T/DFLX014-2021ICS11.220 B41 东丰县鹿业标准 梅花鹿布鲁氏菌病净化措施技术规范 TechnicalspecificationforpurificationmeasuresofbrucellosisinSikaDeer 2021-06-07发布 2021-06-07实施 东丰县梅花鹿产业发展协会发布 全国团体标准信息平台 I前  言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由东丰县梅花鹿产业发展服务中心提出并归口。 本标准起草单位：东丰县梅花鹿产业发展服务中心、东丰县梅花鹿产业发展协会、长春市乾艺生物 科技研究院、东丰县梅花鹿科技服务中心、东丰县黄河镇畜牧兽医站、东丰县农业综合行政执法大队、 吉林农业大学、吉林大学、中国农业科学院特产研究所、长春市农业科学院、吉林农业科技学院。 本标准主要起草人：李铁军、宋国欣、李鸿昌、梁雪峰、唐大伟、程显伟、宋国翠、李男、鞠贵春、 崔鹤馨、魏海军、胡博、权心娇、时坤、王雨千、王晓旭、崔学哲、宫鹏涛、李健明、朱言柱、张鸿、 胡桂英、宋百军、赵立峰、田桂华、赵春梅、张事铭、罗剑通、商业、吕铁峰。 全国团体标准信息平台 T/DFLX014-2021 1梅花鹿布鲁氏菌病净化措施技术规范 1范围 本标准规定了梅花鹿布鲁氏菌病的诊断、疫情报告、生物安全处理、消毒、监测、购鹿及引种、人 员、净化场标准的要求。 本标准适用于东丰县梅花鹿养殖场布鲁氏菌病的净化。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 GB/T18646动物布鲁氏菌病诊断技术 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay 利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利 用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。 3.2 聚合酶链反应polymerasechainreaction 一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的 最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 3.3 生物安全处理biosafetymLdisposal 通过用焚烧、化制、掩埋或其他物理、化学、生物学等方法将病害动物尸体和病害动物产品或附属 物进行处理，以彻底消灭其所携带的病原体，达到消除病害因素，保障人畜健康安全的目的。 4诊断 4.1临床诊断 全国团体标准信息平台 T/DFLX014-2021 2母鹿表现为流产、死胎、不孕和子宫内膜炎等。公鹿表现为附睾炎和睾丸炎。 4.2病理学诊断 4.2.1胎衣呈黄色胶冻样浸润，有些部位覆有纤维蛋白絮片，有出血点。 4.2.2胎儿胃中有淡黄色或白色黏液絮状物，肠胃和膀胱的浆膜下可见有点状或线状出血。 4.2.3皮下呈出血性浆液性浸润。 4.2.4淋巴、脾脏和肝脏有不同程度肿胀。 4.2.5脐带呈浆液性浸润、肥厚，可能有肺炎病灶。 4.3实验室诊断 4.3.1平板凝集实验 4.3.1.1方法 4.3.1.1.1取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成方格，并注明待检血清号码。 4.3.1.1.2取0.2mL吸管分别吸取血清0.08mL、0.04mL、0.02mL和0.01mL各放入一方格内。大 规模检验时，可只做2个血清量，大动物用0.04mL和0.02mL，中小动物用0.08mL和0.04mL。每 检一个样品需换一只吸管。 4.3.1.1.3每格内加布氏杆菌平板凝集抗原0.03mL，滴在血清附近，而不要与血清接触。用牙签（或 火柴杆）自血清量最小的一格起，将血清与抗原混匀，每份血清用一根牙签。 4.3.1.1.4混合完毕，将玻板置凝集反应箱上均匀加温或采用别的办法适当加温，使温度达到30℃ 左右。3min～5min内记录结果。 4.3.1.2结果判定 ＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全清亮透明，即100%凝集。 ＋＋＋：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，即75%凝集。 ＋＋：有可见的凝集片，液体不甚透明，即50%凝集。 ＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即25%的凝集。 －：液体均匀混浊，即不凝集。 以出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数作为该份血清的凝集价。以0.04mL出现凝集价判为该份血清 为布氏杆菌病阳性血清，0.08mL出现凝集价判为可疑。 4.3.2酶联免疫吸附试验 4.3.2.1方法 4.3.2.1.1所有待检血清和对照血清吸取25μL加至1mL血清稀释液中做1/40初始稀释。 4.3.2.1.2取包被酶标板，每孔加入80μL稀释液。 4.3.2.1.3在第1列～10列的各孔分别加入20μL初始稀释的待检血清(终稀释度为1/200)，在第 11列的各孔分别加入20μL初始稀释的阳性对照血清，在第12列的前7个孔分别加入20μL初始稀 释的阴性对照血清，第12列的最后1孔不加入稀释缓冲液做空白对照。 全国团体标准信息平台 T/DFLX014-2021 34.3.2.1.4酶标板加盖，在旋转振荡器上室温孵育30min(或30℃静置1h)。 4.3.2.1.5甩出微孔中的液体，用洗涤液润洗5次，在吸水纸巾上反复拍打酶标板，确保酶标板各孔 内无残留液体。 4.3.2.1.6每孔加入100μL用稀释液稀释至工作浓度的酶标抗体结合物溶液，加盖在旋转振荡器上 室温孵育30min(或30℃静置1h)。 4.3.2.1.7按4.3.2.1.5进行洗涤。 4.3.2.1.8每孔加入100μL配制好的底物显色混合液，在旋转振荡器上室温孵育10min～15min。 4.3.2.1.9每孔加入l00μL终止液。用吸水纸巾吸去酶标板底部的水珠，在酶标仪405nm测定吸光 度(OD)值。 4.3.2.2结果判定 4.3.2.2.1实验成立的条件 a)空白对照孔的OD值和7个阴性对照孔的平均OD值应<0.100，8个阳性孔的平均OD值 应>0.700； b)结合率应≥10，结合率计算按式(1)。 4.3.2.2.2判定 8个阳性对照孔的平均OD值X10%定为阴阳性的临界值。待检血清的OD值≥临界值判为阳性， 待检血清的OD值<临界值判为阴性。 5疫情报告 5.1发现疫情，24h内向当地畜牧兽医行政部门报告。 5.2对病例所在场、群开展流行病学调查，查明发病原因，防止疫情扩大。 6生物安全处理 6.1运送 运送病鹿、病鹿产品及其流产胎儿、胎衣、排泄物、肉等相关产品应采用密闭、不渗水的容器，装 前或卸后必须进行消毒。 6.2方法 6.2.1销毁 将病鹿尸体或其产品投入焚化炉或用其他方式烧毁碳化。 6.2.2掩埋 全国团体标准信息平台 T/DFLX014-2021 46.2.2.1地点应选择远离学校、公共场所、居民居住地、村庄、动物饲养场、屠宰场、饮用水源地、 河流等地区。 6.2.2.2掩埋前需将尸体或产品进行焚烧处理。 6.2.2.3掩埋坑底应铺2cm厚生石灰，掩埋后需将掩埋土夯实，掩埋物上层应距地面1.5m以上。 6.2.2.4掩埋后的地面及掩埋物要求用消毒药进行喷洒清毒处理。 6.2.3记录 做好相关记录、报告、扑杀登记备案等。 7消毒 7.1集中放牧区域夏季通过阳光或者常用消毒药杀菌。 7.2饲养场的金属设施、设备可采取火焰、熏蒸等方式消毒。 7.3流产的胎儿、排泄物和羊水污染的圈舍、场地、车辆等，可选用10%～20%石灰乳或10%～20%漂白 粉不带鹿群消毒。 7.4带鹿消毒可采用适当浓度的过氧乙酸、百毒杀、新洁尔灭等。 7.5鹿场其他区域可用1%～3%来苏溶液、1%～3%漂白粉上清液、0.3%新洁尔灭溶液、0.1%～0.4%二氯 异氰脲酸钠水溶液等消毒药消毒。 7.6饲料、垫料等可采取深埋、发酵处理或焚烧处理。 7.7粪便消毒可采取堆积密封发酵方式处理。 7.8阳性养殖场每天消毒2次，直到养殖场全群监测阴性180d后转入常规消毒。 8监测 8.1有临床症状的鹿场，每年应开展两次100%监测，对检测出阳性的鹿集中淘汰处理，检测结果呈阴 性的鹿进行疫苗注射。 8.2无临床症状的鹿场每年应抽检，比例：100头以下的鹿场抽检率应不低30%，存栏少于20头的散 养户全群采样检测；100头以上的采血抽样检测不低于总数量的20%，一旦发现有感染的鹿按照8.1处 理。 8.3抗体监测，对于注射疫苗的鹿只，每年开展一次抗体监测，抗体效价应较高、均一；抗体效价较 低、不均一的鹿只，应重新注射疫苗。 9购鹿及引种 9.1调入前鹿应全群采样检测，阴性方可调入，调入后隔离饲养21d经二次检测阴性方可混群。 9.2不能从阳性鹿场引种，引种检测阳性的鹿采用不放血方法扑杀。 全国团体标准信息平台 T/DFLX014-2021 510人员 10.1人员防护 按照国家或地方政府有关《布鲁氏菌病高危从业者个人防护技术规范》要求，加强饲养、防疫、检 疫、屠宰、实验室检测人员等从业人员的培训，提高个人防护意识。 10.2宣传教育 加强布鲁氏菌病防控知识的宣传力度，促进饲养人员及相关从业者正确认识其危害，熟悉防护知识， 切实保障人身与财产安全。 11净化场标准 对于注射疫苗的鹿场，应监测抗体，群体抗体应均一、稳定，连续2年以上无临床症状；对于未注 射疫苗的鹿场，连续2年以上血清学监测全部为阴性，抽检鹿副产品检不出布鲁氏菌。 _________________________________ 全国团体标准信息平台