ICS 67.060 B21 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB 37/T 3105—2018 向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准 The variety purity identification technique of sunflower seeds with PAGE 2018 - 02 - 02 发布 山东省质量技术监督局 2018 - 03 - 02 实施 发 布 DB37/T 3105—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由山东省农业厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。 本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。 本标准为首次发布。 I DB37/T 3105—2018 向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准 1 范围 本规程规定了蛋白质电泳的试剂配比、蛋白质提取、凝胶制备、电泳、染色、判别分析等技术要求。 本规程适用于向日葵品种及杂交种种子的纯度室内的快速鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3543 种子检验技术规程 GB 20464 农作物种子标签通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 杂交种 各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。 3.2 品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 3.3 标准样品 能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。 4 原理 4.1 不同品种遗传组成不同，在种子形成时期合成的蛋白质不同。 4.1.1 不同的蛋白质由于分子大小、形状不同，在一定的 pH 条件下所带的电荷多少不同，因此在电场 作用下，在凝胶中移动的快慢不同，通过电泳可以把不同的蛋白质区分开，近而区分不同的亲本和杂交 种。 4.1.2 利用该电泳技术，杂交种具有不育系和恢复系的双亲谱带，双亲有差异蛋白谱带是杂交种纯度 检测的关键位置。 1 DB37/T 3105—2018 4.2 蛋白谱带的命名方法：以点样孔为零点，在凝胶中部每个样品都含有的条带为 50（图 1），在 0～ 50 之间细分为 50 等份作为标尺，50 以下的部分按该标尺进行区分，读取泳道内所有蛋白指纹所处位置 的数值，记为蛋白质谱带名称。 图1 蛋白质谱带命名示意图 5 仪器与试剂 5.1 仪器 单粒种子磨粉器，天平（感量0.0001 g，0.001 g），移液管(10 mL)，离心管（1.5 mL），离心管 架，容量瓶（100 mL、500 mL、1000 mL），微量进样器（1μL～100 μL），离心机，双垂直板电泳槽， 电泳仪，恒温箱，电冰箱，观片灯。 5.2 试剂 丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，冰醋酸，过硫酸铵，尿素，四甲基乙二胺(TEMED)，三氯乙酸，考马 斯亮蓝R-250，十二烷基磺酸钠(SDS)，无水乙醇（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。 6 溶液 6.1 2% SDS 称取2 g SDS倒入100 mL烧杯中，加入去离子水溶解，加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶，4 ℃ 贮存备用。 6.2 蛋白提取液 2 DB37/T 3105—2018 称取18 g尿素，加约50 mL去离子水溶解后加12 mL冰乙酸，3 mL 四甲基乙二胺，7.5 mL 2% SDS， 加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶并加入0.05 g甲基绿，4 ℃贮存备用。 6.3 凝胶溶液 称取50 g丙烯酰胺、50 g尿素、1.0 g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10 g 硫酸亚铁，加去离子水定容至500 mL，4 ℃贮存备用。 6.4 催化剂溶液 称取1.75 g过硫酸铵，加去离子水溶解并定容至50 mL，4 ℃短期贮存。 6.5 电极缓冲液 量取20 mL冰乙酸加水定容至1000 mL。 6.6 染色液 称取0.4 g考马斯亮蓝R-250，用25 mL无水乙醇溶解，倒入染色盘，加50 g～60 g三氯乙酸，加去 离子水500 mL，搅匀。 7 操作程序 7.1 蛋白质提取 7.1.1 从送验样品中随机数取向日葵种子 200 粒，将种子去壳后用单粒种子磨粉器压碎，放入 1.5 mL 离心管中，按向日葵种子与提取液质量体积比 1:6 加蛋白提取液、摇匀，25 ℃提取 20 min， 用离心 机 4000 g 离心 4 min，取上清液备用。 7.1.2 与标签值比较时，为了减少工作量，可以顺序测定 50 粒/次，将测定结果与标签值比较是否在 允许误差范围内。 7.2 凝胶制备 将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取40 mL凝胶溶液于烧杯 中，加65μL～80 μL催化剂溶液，迅速搅匀沿玻璃棒向玻璃板中倒满凝胶溶液，迅速插入样品梳，2 min～ 3 min聚合后将样品梳拔出，吸出样品槽中的水分，将玻璃板固定在电泳槽内。 7.3 点样 用微量移液器取离心后的样品上清液30 μL加入样品槽，每加一个样品后，用去离子水清洗移液器 两次。 7.4 电泳 加样完毕后，加入2 %电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃 板，将电源线正极接上槽，负极接下槽。接通电源，85 mA稳流电泳2 h。 7.5 卸板、染色 倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液中染色12 h左右。 7.6 电泳分析 3 DB37/T 3105—2018 7.6.1 取出凝胶洗净，在观片灯上观察蛋白质谱带，鉴定各泳道谱带的特征和一致性。 7.6.2 检测时以标准样品为参考，以亲本与杂交种的互补带为依据，分析杂粒和自交粒。 7.6.3 谱带与标准样品不一致的记为非本品种籽粒，非本品种籽粒谱带中仅在互补谱带位置缺少某一 亲本的为自交粒。 8 结果计算 待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性，计数供检样品粒数（N）和非本 品种粒数（M），并按式计算电泳测定值X %（保留一位小数）。 X（%）=（N - M）/N×100 9 结果报告 参照GB/T 3543，写明对照样品名称，检测粒数，纯度%。对送样样品的检验需注明：“结果仅对样 品负责”。监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。 _________________________________ 4