(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210480607.9 (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 河北科技大学 地址 050018 河北省石家庄市裕华区裕翔 街26号 申请人 石家庄秀卿生物科技有限公司 　 石家庄博维生物科技有限公司 (72)发明人 高辉明　韩江雪　王雁伟　艾鹏飞　 陈珊珊　张向阳　张贵海　 (74)专利代理 机构 北京名华博信知识产权代理 有限公司 1 1453 专利代理师 韩闪闪 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 四种食源性致病菌的多重PCR检测试剂及检 测方法 (57)摘要 本申请公开了一种用于检测四种食源性致 病菌的多重PCR检测试剂及检测方法。 所述用于 检测四种食源性致病菌的多重PCR检测试剂包 括： InlA基因的引物对、 cytK基因的引物对、 wzy 基因的引物对、 spv基因的引物对； 其中， 所述 InlA基因的引物对用于检测单增李斯特菌， 所述 cytK基因的引物对用于检测蜡样芽孢杆菌， 所述 wzy基因的引物对用于检测产 志贺毒素大肠埃希 氏菌， 所述 spv基因的引物对用于检测沙门氏菌。 所述用于多重检测四种食源性致病菌的检测方 法可以一次性同时检测单增李斯特菌、 蜡样芽孢 杆菌、 产志贺毒素大肠埃希氏菌和沙门氏菌这4 种致病菌， 并且检测的特异性高、 灵敏度高、 便捷 高效。 权利要求书2页 说明书19页 序列表2页 附图3页 CN 115433782 A 2022.12.06 CN 115433782 A 1.一种用于检测四种食源性致病菌的多重PCR检测试剂， 其特征在于， 包括： InlA基因 的引物对、 cytK基因的引物对、 wzy基因的引物对、 spv基因的引物对； 其中， 所述InlA基因的引物对用于检测单增李斯特菌， 所述cytK基因的引物对用于检 测蜡样芽孢杆菌， 所述wzy基因的引物对用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌， 所述spv基因 的引物对用于检测沙门氏菌 。 2.根据权利要求1所述的检测试剂， 其特征在于， 所述InlA基因的引物对如SEQ  ID NO： 1‑2所示， 所述cytK基因的引物对如SEQ  ID NO： 3‑4所示， 所述wzy基因的引 物对如SEQ  ID  NO： 5‑6所示， 所述spv基因的引物对如SEQ  ID NO： 7‑8所示。 3.一种用于检测四种食源性致病菌的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法利用InlA 基因的引物对、 cytK基因的引物对、 wzy基因的引物对、 spv基因的引物对， 在一次PCR反应中 同时检测待测样品中的单增李斯特菌、 蜡样芽孢杆菌、 产志贺毒素大肠埃希氏菌、 沙门氏 菌； 其中， 所述InlA基因的引物对用于检测单增李斯特菌， 所述cytK基因的引物对用于检 测蜡样芽孢杆菌， 所述wzy基因的引物对用于检测产志贺毒素大肠埃希氏菌， 所述spv基因 的引物对用于检测沙门氏菌 。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于， 包括： 设计所述InlA基因的引 物对、 所述cytK基因的引 物对、 所述wzy基因的引物对、 以及所 述spv基因的引物对； 提取所述待测样品的DNA； 以提取的所述待测样品DNA为模板， 加入所述InlA基因的引物对、 所述cytK基因的引物 对、 所述wzy基因的引物对、 以及所述spv基因的引物对， 进行PCR反应； 将PCR反应产物经凝胶电泳分离， 在凝胶成像系统下拍照， 得到 凝胶电泳图； 根据所述凝胶电泳图， 同时判定待测样品中是否含有单增李斯特菌、 蜡样芽孢杆菌、 产 志贺毒素 大肠埃希氏菌和沙门氏菌 。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 在进行所述PCR反应时， PCR反应体系 为30 μL； 所述InlA基因的引物对包括上游引物InlA ‑F和下游引物InlA ‑R， 所述cytK基因的引物 对包括上游引物cytK ‑F和下游引物cytK ‑R， 所述wzy基因的引物对包括上游引物wzy ‑F和下 游引物wzy ‑R， 所述spv基因的引物对 包括上游引物spv ‑F和下游引物spv ‑R； 所述PCR反应体系包括： 15 μL的2 ×Rapid Taq Master Mix， 0.5 μL的上游引物InlA ‑F， 0.5 μL的下游引物InlA ‑R， 0.5 μL的上游引物cytK ‑F， 0.5 μL的下游引物cytK ‑R， 0.5 μL的上游 引物wzy‑F， 0.5 μL的下游引物wzy ‑R， 0.5 μL的上游引物spv ‑F， 0.5 μL的下游引物spv ‑R， 0.5 μ L的待测样品DNA模板， 余 量为超纯水。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述InlA基因的引物对的浓度为10μ mol/L， 所述cytK基因的引物对的浓度为10 μmol/L， 所述wzy基因的引物对的浓度为10 μmol/ L， 所述spv基因的引物对的浓度为10 μmo l/L。 7.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述PCR反应的反应条件为： 95℃预变 性3min； 95℃变性30s， 58℃退火20s， 72℃延伸30s， 共进行35个循环； 72℃延伸5min； 4℃保 存PCR产物。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115433782 A 28.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶电泳的电压为110 ‑130V， 所 述凝胶电泳的持续时间为0.5 ‑1.5h。 9.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳， 其 中， 琼脂糖凝胶的浓度为0.5 ‑1.5％。 10.一种用于多重检测四种食 源性致病菌的检测试剂盒， 其特 征在于， 包括： 容器， 以及位于容器内的根据权利要求1所述的检测试剂。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115433782 A 3