(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210482401.X (22)申请日 2022.05.05 (71)申请人 深圳联合医学 科技有限公司 地址 518000 广东省深圳市南 山区西丽 街 道留仙洞村留仙文化园 （原 ‘桑泰科技 园’） 第6栋2楼202室 (72)发明人 雷湘华　叶苑青　郭永超　徐仲尧　 王艳平　蔡锦刚　 (74)专利代理 机构 深圳中一联合知识产权代理 有限公司 4 4414 专利代理师 曹柳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 跨越断裂点PCR联合多重PCR进行检测的引 物组及试剂盒 (57)摘要 本申请涉及测序技术领域， 尤其涉及一种跨 越断裂点PCR联合多重PCR进行基因检测的引物 组及试剂盒， 提供了一种跨越断裂点PCR联合多 重PCR进行测序的引物组， 所述引物组包括第一 引物、 第二引物、 第三引物、 第四引物及第五引 物， 所述第一引物从5 ’端到3’端依次包括特异性 引物和第一测序标签， 第二引物从5 ’端到3’端依 次包括特异性引物和第二测序标签， 其中， 所述 特异性引物包括上断裂点的正向引物和上断裂 点的反向引物， 下断裂点的正向引物和下断裂点 的反向引物。 采用该引物组可快速对样品基因的 全外显子是否存在基因大面积缺失或插入进行 分析， 速度快， 准确率高。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图1页 CN 114807329 A 2022.07.29 CN 114807329 A 1.一种跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括 第一引物、 第二引物、 第三引物、 第四引物及第五引物， 所述第一引物从5 ’端到3’端依次包 括特异性引物和第一测序标签， 所述第二引物从5 ’端到3’端依次包括特异 性引物和第二测 序标签， 其中， 所述特异性引物包括上断裂点的正向引物和上断裂点的反向引物， 下断裂点 的正向引物和下断裂点的反向引物。 2.根据权利 要求1所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物 组， 其特征在于， 所述上断裂点的正向引物和所述下断裂点的反向引物进行扩增得到的片段长度为125 ‑ 700bp。 3.根据权利 要求1所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物 组， 其特征在于， 所述特异性引物的长度为17～ 25bp。 4.根据权利 要求1～3任一所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物组， 其特 征在于， 所述第三引物由第一测序接 头、 样本标签、 第二测序标签组成； 和/或， 所述第四引物由第二测序接 头、 第一测序标签组成； 和/或， 所述第五引物为第一测序接 头。 5.根据权利 要求4所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物 组， 其特征在于， 所述第一测序标签的序列如Seq.ID  No.1所示； 和/或， 所述第二测序标签的序列如Seq.ID  No.2所示； 和/或， 所述第一测序接 头的序列如Seq.ID  No.3所示； 和/或， 所述第二测序接 头的序列如Seq.ID  No.4所示。 6.一种跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求1～5任一所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的引物组。 7.根据权利 要求6所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括PCR缓冲液、 DNA聚合酶。 8.一种采用如权利要求6所述的跨越断裂点PCR联合多重PCR进行测序的试剂盒检测基 因大面积缺失或插 入的方法， 其特 征在于， 所述方法为非诊断用途， 包括以下步骤： 提供待测样本的DNA模板； 利用第一引物、 第二引物和第三引物对所述样本DNA进行第一轮多重PCR反应， 得到扩 增产物； 利用第四引物和第五引物对所述扩增产物进行第二轮多重PCR反应， 得到待测样本文 库； 对所述待测样本文库进行测序， 分析待测样本是否存在基因大面积缺失或插 入。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 进行第 一轮多重PCR反应的步骤中， 分成两 个反应体系同时进行第一轮多重PCR反应， 其中， 第一反应体系为DNA模板5～75ng， DNA聚合 酶3～3.2U， 扩增缓冲液15.5～16 μL， 部分第一引物浓度为1～1.1 μM、 0.5～0.6 μL， 部分第二 引物浓度为1～1.1μM、 0.17～0.18 μL， 第 三引物浓度为50～52 μM、 1.39～1.40 μL， 加双蒸水 至25 μL； 第二反应体系为DNA模板5～75ng， DNA聚合酶3～3.2U， 扩增缓冲 液15.5～16 μL， 剩 余第一引物浓度为1～1.1μM、 0.5～0.6 μL， 剩余第 二引物浓度为1～1.1μM、 0.17～0.18 μL， 第三引物浓度为5 0～51 μM、 1.4 4～1.5 μL， 加双蒸水至25 μL； 所述第一轮多重PCR反应的反应条件如下： 94～95℃3～4min预变性； 94～95℃30～权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807329 A 235s， 60～61℃2 ～2.5min， 58～59℃2 ～2.5min， 72～73℃3～3.5mi n， 20个循环； 于4℃保存。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 进行第二轮多重PCR反应的步骤中， 所述 第二轮多重PCR反应的体系为扩增产物10～11μL， 2 ×高保真热启动聚合酶预混液25～27μ L， 第四引物浓度为25～26 μM、 1.5～1.6 μL， 第五引物浓度为25～26 μM、 1.5～1.6 μL， 加双蒸 水至50 μL； 所述第二轮多重PCR反应的反应条件如下： 94～95℃3～4min预变性； 94～95℃30～ 35s， 60～61℃3 0～35s， 72～73℃40～45s， 15个 循环； 72～73℃3～3.5mi n， 于4℃保存。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807329 A 3