(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210487983.0 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 武汉希望组生物科技有限公司 地址 430076 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区花城大道8号武汉软件新城二期 C11栋19层 (72)发明人 梁帆　全伟鹏　李净净　汪德鹏　 (74)专利代理 机构 东莞市卓易专利代理事务所 (普通合伙) 44777 专利代理师 张晓华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于LAMP检测传染性疾病病毒的引物组、 试 剂盒及测序方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于LAMP快速检测传染 性疾病病毒的引物组、 试剂盒及测序方法， 涉及 生物检测技术领域。 所述传染性疾病选自SARS ‑ CoV‑2或流感病毒B， 所述引物组包括特异性扩增 SARS‑CoV‑2病毒arf1ab和N基因的引物对， 如Seq   ID No.1～12所示， 或特异性扩增流感病毒B的HA 基因和M基因的引物对， 如Seq  ID No.13～24所 示， 同时， 引物组还包括特异性扩增作为内参基 因的GAPDH的引物对， 如Seq  ID No.25～30所示。 本发明提供的引物组、 试剂盒及测序方法可在2 小时内检出低至32 5copies/mL的目标物， 与传统 的qPCR检测相比， 可以实现快速、 高效、 高准确的 检测。 权利要求书2页 说明书10页 序列表5页 附图1页 CN 114752708 A 2022.07.15 CN 114752708 A 1.一种基于LAMP快速检测传染性疾病病毒的引物组， 其特征在于， 所述传染性疾病选 自SARS‑CoV‑2或流感病毒B， 所述引物组包括特异性扩增SARS ‑CoV‑2病毒arf1ab和N基因的 引物对， 如Seq  ID No.1～12所示， 或特异性扩增流感病毒B的HA基因和M基因的引物对， 如 Seq ID No.13～24所示， 同时， 引物组还包括特异性扩增作为内参基因的GAPDH的引物对， 如Seq ID No.25～30所示。 2.一种基于LAMP快速检测传染性疾病病 毒的试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要求1所 述的SARS ‑CoV‑2病毒arf1ab和N基因的引物对和/或流感病毒B的HA基因和M基因的引物对。 3.根据权利要求2所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒的试剂盒， 其特征在于， 包 括以下成分： 组分 浓度 Isothermal  Amplification Buffer 10× MgSO4100mmol/L dNTP Mix 10mmol/L FIP/BIP Primers 25× F3/B3 Primers 25× LoopF/B Primers 25× Bst2.0 DNA Polymerase 8,000U/ml Nuclease ‑free Water ‑ 4.一种基于LAMP快速检测传染性疾病 病毒序列的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S41： 对待检样品提取质粒样本， 获得DNA  Sample； S42： 进行LAMP反应， 并对反应产物进行 纯化， 其中， 每25 μL体积的LAMP反应 体系为： 试剂 添加量 10×Isothermal  Amplification Buffer 2.5 μl MgSO4(100mmol/L) 1.5 μl dNTP Mix(10mmol/L) 3.5 μl FIP/BIP Primers(25 ×) 1 μl F3/B3 Primers(25 ×) 1 μl LoopF/B Primers(25 ×) 1 μl Bst2.0 DNA Polymerase(8,0 00U/ml) 1 μl DNA Sample 10 μl Nuclease ‑free Water 至25 μl S43： 取步骤S42中纯化后的LAMP产物与Fragmentation  Mix RB01‑12混合反应， 待反应 完全后， 冰浴降温， 再使用AMPure  beads纯化， 将纯化后的产物与RAP混合， 室温孵育， 连接 测序接头； S44： 上样， 采用Nan opore平台测序。 5.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在于， 所述步骤S41中， DNA  Sample的制备方式为： 将提取获得的质粒样本行等量混合， 并将其浓 度调整至 3.25×105copies/mL。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752708 A 26.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在于， 所述步骤S42中， LAMP反应在6 5℃条件下反应3 0min。 7.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在于， 所述步骤S42中， 反应产物使用35 μl  AMPure XP beads、 Qubit  dsDNA HS Assay Kit进行纯 化。 8.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在于， 所述步骤S43中， 纯化后的LAMP产物与Fragmentation  Mix RB01‑12的体积比为3:1， 先30℃ 反应1min， 然后80℃反应1mi n， 再冰浴降温。 9.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在于， 所述步骤S43中， 使用AMPure  beads纯化的方法为： 向反应产物中加入等体积AMPure   beads， 室温孵育15min， 再室温磁力架吸附5min， 弃上清； 加 入70％乙醇， 磁力架吸附， 弃上 清， 重复一次； 室温晾干； 加入终浓度为20mmol/L、 pH为7.5 ‑8.0的Tris ‑HCl溶液和终浓度为 100mmol/L的NaCl溶液共10ul， 其中Tris ‑‑HCl溶液与NaCl溶液的体积比为1:1， 室温孵育 2min； 磁力架上静置 5min， 吸取上清， 即为纯化后的产物。 10.根据权利要求4所述的基于LAMP快速检测传染性疾病病毒序列的方法， 其特征在 于， 所述步骤S43中， RAP与纯化后的产物的体积比为1:10 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752708 A 3