(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210485643.4 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 山东康华生物医疗科技股份有限公 司 地址 261023 山 东省潍坊市经济开发区月 河路699号 申请人 青岛汉唐生物科技有限公司 (72)发明人 田永帅　杨帆　朱青　刘嘉男　 刘万建　宋金铃　左雪梅　 (74)专利代理 机构 潍坊盛润知识产权代理事务 所(普通合伙) 37299 专利代理师 李光林 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探 针组合物、 核酸检测试剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明提供用 于检测犬片状边虫与巴贝斯 虫的引物探针组合物、 核酸检测试剂盒及其制备 方法， 所述引物探针组合物包括用于检测犬片状 边虫的上游引物、 用于检测犬片状边虫的下游引 物、 用于检测犬片状边虫的荧光探针、 用于检测 犬巴贝斯虫的上游引物、 用于检测犬巴贝斯虫的 下游引物、 用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针、 外 参照的上游引物、 外参照的下游引物、 外参照的 荧光探针。 本发明引物和探针具有较高的保守 性， 与其他病原体不存在交叉反应。 本发明核酸 检测试剂盒特异性强、 灵敏度高。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 114703308 A 2022.07.05 CN 114703308 A 1.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物， 其特征在于： 包括用于检测犬 片状边虫的上游引物、 用于检测犬片状边虫的下游引物、 用于检测犬片 状边虫的荧光探针、 用于检测犬巴贝斯虫 的上游引物、 用于检测犬巴贝斯虫 的下游引物、 用于检测犬巴贝斯虫 的荧光探针、 外参照的上游引物、 外参照的下游引物、 外参照的荧光探针； 所述用于检测犬 片状边虫的上游引物： 序列如SEQ  ID NO: 1所示； 所述用于检测犬片状边虫的下游引物： 序 列如SEQ ID NO: 2所示； 所述用于检测犬片状边虫的荧光探针： 序列如SEQ  ID NO: 3所示， 所述用于检测犬巴贝斯虫的上游引物： 序列如SEQ  ID NO: 4所示； 所述用于检测犬巴贝斯 虫的下游引物： 序列如SEQ  ID NO: 5所示； 所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针： 序列如 SEQ ID NO: 6所示； 所述外参照的上游引物： 序列如SEQ  ID NO: 7所示， 所述外参照的下游 引物： 序列如SEQ  ID NO: 8所示； 所述外参照的荧 光探针： 序列如SEQ  ID NO: 9所示。 2.根据权利要求1所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物， 其特征 在于： 所述用于检测犬片状边虫的荧光探针： 5 ’端标记FAM荧光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基 团； 所述用于检测犬巴贝斯虫的荧光探针：  5’端标记CY5荧光基团， 3 ’端标记BHQ2淬灭基 团； 所述外参照的荧 光探针： 5’端标记VIC荧光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 3.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒， 其特征在于： 包括PCR反应液、 酶混合液、 阴性对照品以及阳性对照品； 所述PCR反应液包括PCR反应Buffer、 具有如SEQ  ID  NO: 1‑SEQ ID NO: 9所示序列的引物和探针。 4.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒， 其特征 在于： 所述阴性对照品： TE  buffer。 5.根据权利要求3所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒， 其特征 在于： 所述阳性对照品： 含犬片状边虫人工合 成质粒、 巴贝斯虫人工合成质粒和外参照人工 合成质粒， 浓度均为1 ×106拷贝/mL。 6.用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方法， 其特征在于： 包括 设计引物探针、 构建反应体系以及建立反应程序； 所述设计引物探针： 针对片状边虫16S   ribosomal  RNA gene设计用于检测犬片状边虫的上下游引物和探针， 序列如SEQ  ID NO:  1‑SEQ ID NO:3； 针对巴贝斯虫small  subunit ribosomal  RNA gene设计用于检测巴贝斯 虫的上下游引物和探针， 序列如SEQ  ID NO: 4‑SEQ ID NO:6； 针对拟南芥SUC2基因设计外 参照的上 下游引物和探针， 序列如SEQ  ID NO: 7‑SEQ ID NO:9。 7.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方 法， 其特征在于： 所述构建反应体系： PCR反应Buffer的终浓度为1 ×； 用于检测犬片状边虫 的引物SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的终浓度均为0.2μM； 用于检测巴贝斯虫的引 物SEQ  ID NO: 4和SEQ ID NO:5的终浓度均为0.2 μM； 用于检测犬片状边虫的探针SEQ  ID NO: 3、 用于检测巴贝斯虫的探针SEQ  ID NO: 6以及外参照的引物探针SEQ  ID NO: 7‑SEQ ID NO:  9的终浓度均为0.2  μM； 酶混合液在反应 体系中的终浓度为1 ×。 8.根据权利要求6所述的用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的核酸检测试剂盒的制备方 法， 其特征在于： 所述建立反应程序： 第一步： 温度50℃， 时间2  min； 第二步： 温度95℃， 时间 10min； 第三步： 温度94℃， 时间15s， 第四步： 温度60℃， 时间40s， 其中第三步与第四步循环 40次， 在第四步时采集 荧光信号。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703308 A 2用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、 核酸检 测试剂盒及其制备方 法 技术领域 [0001]本发明涉及核酸检测技术领域， 具体涉及用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物 探针组合物、 核酸检测试剂盒及其制备 方法。 背景技术 [0002]犬片状边虫 （ Anaplasm a platys） 是引起犬周期性血小板减少症的病原虫， 主要是 热带及温暖地区的犬易受影响， 是一种广泛传播的疾病， 革蜱属被认为属犬片状边虫 的传 播媒介。 片状边虫感染的症状包括 发烧、 食欲减退， 嗜睡， 凝血异常及中度贫血等症状。 目前 用于片状边虫诊断的方法包括血 液抹片， 血清诊断及分子诊断。 [0003]犬巴贝斯虫病 是由于巴贝斯虫 （ Babesiagib soni） 寄生在宿主犬的红细胞中引起 的一种严重的血液原虫疾病， 能会造成的症状有发热、 贫血、 黄疽、 脾肿大、 血红蛋白尿、 可 视粘膜苍白等， 重的可伴随急性肾衰、 急性呼吸窘迫综合症， 弥散性血管内凝血， 肝病及神 经综合症。 巴贝斯虫属于梨形虫目 （ Piroplasmida ） 巴贝斯科 （ Babesiidae ） 巴贝斯属 （Babesia） ， 是以蜱虫为中间宿主和传播媒介， 在世界广泛流行。 目前用于犬巴贝斯虫的诊 断方法有临床诊断、 血常规检查、 尿液检查、 血 液涂片检查 等。 [0004]目前诊断犬片状边虫与巴贝斯虫的最佳方式是分子诊断， 尤其是利用聚合酶链式 反应 （polymerase  chain reaction， PCR） 进行检测， 这是一种更灵敏， 且更具有专一性的技 术。 但目前的犬片 状边虫与巴贝斯虫的P CR检测试剂盒存在以下技术缺陷： 引物探针保守性 较差， 试剂盒检测的灵敏度较低； 犬片状边虫与犬巴贝斯虫 无法同时检测， 费时费力。 发明内容 [0005]针对以上现有技术的缺陷， 本发明提供用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探 针组合物、 核酸检测试剂盒及其制备方法， 并达到以下发明目的： 提高引物探针保守性、 检 测灵敏度， 可同时检测犬片状边虫与犬巴贝斯虫， 方便快捷。 [0006]为实现以上发明目的， 本发明采用以下技 术方案： 分别设计犬片状边虫、 巴贝斯虫与外参照的引物探针序列， 共九条序列， 如下所 示： 用于检测犬片 状边虫的上游引物： 5 ’ ‑gcctaccaaggcagtgatctat ‑3’， 序列记为SEQ  ID NO: 1。 [0007]用于检测犬片状边虫的下游引物： 5 ’ ‑cccattgtccaatattccccactg ‑3’， 序列记为 SEQ ID NO: 2。 [0008]用于检测犬片 状边虫的荧光探针： 5 ’ ‑cagccacactggaactgagatacggtc ‑3’， 序列记 为SEQ ID NO: 3， 其中探针5 ’端标记FAM荧 光基团， 3 ’端标记BHQ1淬灭基团。 [0009]用于检测犬巴贝斯虫的上游引物： 5 ’ ‑ccgtgctaattgtagggctaatac ‑3’， 序列记为 SEQ ID NO: 4。说　明　书 1/8 页 3 CN 114703308 A 3