(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210486514.7 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 南京大学 地址 210023 江苏省南京市栖霞区仙林大 道163号 (72)发明人 陈熹　梁高丽　朱晓菊　张子璇　 詹守斌　胡欢欢　王延博　张辰宇　 (74)专利代理 机构 北京智丞瀚方知识产权代理 有限公司 1 1810 专利代理师 姜司晨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代 精神状况的产品中的应用 (57)摘要 本发明提供了miRNA标志物检测试剂在制备 用于预测子代精神状况的产品中的应用， 所述 miRNA标志物为 miR‑9‑5p和/或miR ‑9‑3p。 与现有 技术相对比， 本发明具有以下优点： 本发明提供 的miRNA标志物 检测试剂在制备用于预测子代精 神状况的产品中的应用， 公开了 “代际表观遗传 因子”， 即生殖细胞内的miR ‑9‑5p和miR‑9‑3p， 二 者介导了雄性高龄生育致子代焦虑和社交障碍 易感的表观 遗传现象。 miR ‑9‑5p和miR‑9‑3p对子 代焦虑和社交障碍易感检测的特异性和灵敏度 较高， 通过检测上述标志物， 可 以使高龄人群的 “优生优育 ”理念有效提升， 也能够用于子代精神 异常易感的辅助早期诊断。 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图6页 CN 114891875 A 2022.08.12 CN 114891875 A 1.miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品中的应用， 其特征在于， 所述miRNA标志 物为miR‑9‑5p和/或miR ‑9‑3p。 2.根据权利要求1所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特征在于， 所述miR ‑9‑5p的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示， 所述miR ‑9‑3p的 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示。 3.根据权利要求1或2所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产 品中的应用， 其特征在于， mi R‑9‑5p的检测引物包括第一逆转录引物、 第一正向引物和第一 反向引物； 所述第一逆转录引物的核苷 酸序列如S EQ ID NO： 3所示， 第一正向引物的核苷 酸 序列如SEQ  ID NO： 4所示， 第一反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 5所示。 4.根据权利要求3所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特征在于， 所述miRNA标志物检测试剂中， 还包括有用于检测所述miRNA标志物 miR‑9‑5p表达量的内参基因引物， 所述内参基因引物包括第三逆转录引物、 第三正 向引物 和第三反向引物； 所述第三逆转录引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO： 9所示， 第三正向引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 10所示， 第三反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 11所示。 5.根据权利要求1或2所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产 品中的应用， 其特征在于， mi R‑9‑3p的检测引物包括第二逆转录引物、 第二正向引物和第二 反向引物； 所述第二逆转录引物的核苷 酸序列如S EQ ID NO： 6所示， 第二正向引物的核苷 酸 序列如SEQ  ID NO： 7所示， 第二反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 8所示。 6.根据权利要求5所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特征在于， 所述miRNA标志物检测试剂中， 还包括有用于检测所述miRNA标志物 miR‑9‑3p表达量的内参基因引物， 所述内参基因引物包括第四逆转录引物、 第四正 向引物 和第四反向引物； 所述第四逆转录引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 12所示， 第四正向引物 的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 13所示， 第四反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 14所示。 7.根据权利要求1 ‑6任一所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况 的产品中的应用， 其特征在于， 所述miRNA标志物 为父代精子中的miRNA标志物， 优选为高龄 父代精子中的miRNA标志 物。 8.根据权利要求7所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特 征在于， 所述子代 精神状况 是指子代 精神焦虑或社交障碍易感。 9.根据权利要求8所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特征在于， 是对miRNA标志物miR ‑9‑5p和/或miR ‑9‑3p的表达量进行检测， 检测 方法包括以下步骤： S1.精液样本的处 理， 离心、 精子提取、 保存备用； S2.总RNA的提取； S3.使用超微 量分光光度计检测RNA的总量； S4.进行逆转录获得cDNA， 将得到的cDNA进行荧 光定量检测。 10.根据权利要求9所述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用， 其特征在于， 所述产品为试剂盒， 所述试剂盒中还包括以下制剂： dNTP/AMV逆转 录酶、 缓冲液、 MgCl2、 DEPC水和Taq酶。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891875 A 2miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状况的产品 中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及miRNA标志物检测试剂在制  备用于预测 子代精神状况的产品中的应用。 技术背景 [0002]有研究数据显示， 40岁以上的男性使女性在12个月内受孕的可能性，  比30岁以下 的男性低30％以上， 而对45岁及以上的男性来说， 其使女性受孕  所需时间是25岁以下男性 的5倍。 《英国医学杂志》 上有研究指出， 父亲的年  龄越大， 新生儿早产风险越高， 出生体重 越低。 此外还有多项研究表明， 男性  生育年龄越高， 子女出现精神分裂疾病的概率越大， 出 现症状越早， 数据显示，  40岁以上男性生育的子女， 罹患孤独症谱系障碍的风险会升高 4.75倍。 随着父  辈生育年龄增加， 对子代精神健康存在很大威胁。 因此， 探究高龄父辈生育 子 代的精神健康是否受到父辈高龄的影响， 其机制如何， 将对预防父辈高龄对子  代精神 健康产生影响具有重要意义。 申请人前期研究发现父本高龄生育得到的  子代小鼠具有精 神异常相关表型， 提示父本高龄通过代际表观遗传方式影响子  代精神健康， 并且高龄小鼠 精子小RNA 导致胚胎细胞基因转录水平发生显著  变化， β‑雌二醇(17β ‑雌二醇)通路存在异 常， 进一步高龄小鼠和人的精子中某些  miRNA(如miR ‑9‑5p、 miR‑9‑3p等)高表达， 且注射合 成的miR‑9‑5p、 miR‑9‑3p 进入正常受精卵诱导早期胚胎β ‑雌二醇通路表达异常， 移植后得 到的子代同样  具有精神异常表型， 表明高龄精子miR ‑9‑5p、 miR‑9‑3p介导了父本高龄诱导 子 代精神异常表型代际表 观遗传的过程。 [0003]然而， 精子内miRNA在子代精神异常无创诊断中的应用前景仍有待发  掘， 如果能 筛选到精子内异常表达的miRNAs作为生物标志物， 并研发相应的  诊断试剂盒， 对高龄父亲 生育子代精神状况的诊断现状将会有大 大的推动。 [0004]由于miRNA在机体内含量通常较低， 尤其是精子等小量 的体液中， 其  检测难度极 大， 现有的检测试剂无法实现miRNA标志 物的有效定量检测。 发明内容 [0005]针对上述存在的拘束局限性， 本 发明提出了一种miRNA标志物检测试  剂在制备用 于预测子代 精神状况的产品中的应用； 克服了背景技 术中提到的不  足和缺陷。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用了以下技 术方案： [0007]本发明的发明点是提供了miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代  精神状况 的产品中的应用， 所述miRNA标志 物为miR‑9‑5p和/或miR ‑9‑3p。 [0008]检测时， 可单独检测miR ‑9‑5p标志物、 单独检测miR ‑9‑3p标志物， 更  优的方式是 将miR‑9‑5p和miR‑9‑3p标志物共同进行检测， 综合二者的检测结  果， 再用于预测子代的精 神状况。 [0009]进一步的， 上述的miRNA标志物检测试剂在制备用于预测子代精神状  况的产品中说　明　书 1/11 页 3 CN 114891875 A 3