(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210486781.4 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 江苏吉诺思美精准医学 科技有限公 司 地址 210000 江苏省南京市南京经济技 术 开发区恒泰路汇智科技园A 9栋 (72)发明人 孙克京　高如霞　李丽蓉　贾春蕾　 (74)专利代理 机构 南京中律知识产权代理事务 所(普通合伙) 32341 专利代理师 沈振涛 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种基于 数字PCR检测EGF R 19del的引物 探 针组合物、 试剂盒和检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于数字PCR检测EGFR   19del的引物探针组合物、 试剂盒和检测方法。 所 述引物探针组合物包括一对19del位点特异性引 物和一对竞争性结合探针， 其能够在ddPCR仪上 实现基因突变定性定量检测。 本发 明引物探针组 合物用于数字PCR检测EGFR  19del， 方法操作简 便， 结果准确直观， 可应用于组织和cfDNA等样本 的检测， 具有很高的灵敏度和特异度。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114908086 A 2022.08.16 CN 114908086 A 1.一种基于数字PCR检测EGFR  19del的引物探针组合物， 其特征在于， 所述组合物包括 如下所示的一对特异性引物和一对竞争性结合探针： 正向引物:CTCTCTGTCATAG GGACTCTGGA(SEQ ID NO 1) 反向引物:CACATCGAG GATTTCCTTGTTG(SEQ ID NO 2) 探针1:AGA AAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCA(SEQ  ID NO 3) 探针2:TCGCTATCA AGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG(SEQ ID NO 4)。 2.一种基于数字PCR检测EGFR  19del的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包含权利要求 1所述的引物探针组合物。 3.权利要求1所述的引物探针组合物， 或权利要求2所述的试剂盒在基于数字PCR检测 EGFR 19del中的应用。 4.一种基于数字PCR检测EGFR  19del的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)将数字PCR预混液与待测的DNA样本、 权利要求1所述的引物探针组合物混合， 制备 得到数字PCR混合液； (2)将数字PCR混合液制备成微 滴， 然后进行PCR扩增反应； (3)对PCR扩增反应后的产物进行信号分析， 在分析软件中根据不同的荧光信号来判断 待测样本的突变情况， 并计算 突变模板的含量。 5.根据权利要求4所述的基于数字PCR检测EGFR  19del的方法， 其特征在于， 步骤(2) 中， 所述PCR扩增反应的条件为： 95℃， 10min； 94℃， 30s； 60℃， 60s； 98℃， 10min； 4℃， 终止； 其中， 94℃和6 0℃进行40个 循环， 升降温速度为2℃/s。 6.根据权利要求4所述的基于数字PCR检测EGFR  19del的方法， 其特征在于， 步骤(2) 中， 所述PCR扩增反应的体系包括： ddPCRSupermix  for Probes(No  dUTP)、 待测的DNA样本、 权利要求1所述的引物探针 组 合物和水。 7.根据权利要求4所述的基于数字PCR检测EGFR  19del的方法， 其特征在于， 步骤(3) 中， 将PCR扩增反应后产物放入微滴读取仪中进行微滴读取， 在软件上查看和分析结果， 将 不同荧光信号的微滴分成4种类型， 无模板微滴/突变型微滴/野生型微滴/杂合型微滴； 当 突变型微 滴数≥3个时判定为 突变型， 并计算 突变频率Fracti onal Abundance＝(a/a+b)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908086 A 2一种基于数字PCR检测EGFR  19del的引物探针组合物、 试剂盒 和检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于EGFR基因突变检测技术领域， 具体涉及一种基于数字PCR检测EGFR   19del的引物探针组合物、 试剂盒和检测方法。 背景技术 [0002]目前中国的肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位， 防治形势非常严 峻。 不过， 近几年非小细胞肺癌NSCLC已经成为精准医疗领域发展最成功的一个范例。 在中 国非小细胞肺癌患者中约有一半都含有EGFR突变， EGFR有多种 突变， 分为敏感突变和耐药 突变， 敏感突变最主要的是19del和L858R突变， 占全部敏感突变的约90％， 19del又占到其 中的一半， 而耐药突变最主要的是T790M突变和20ins突变。 EGFR敏感突变可以使用 Gefitinib/Erlotinib/Afati nib等TKIs靶向抑制剂治疗， 具有良好的疗效。 [0003]对基因突变进行检测是精准医疗的第一步， 目前大多是对肿瘤组织中DNA进行基 因检测。 近年来， 随着检测技术的进步和液体活检的巨大优势， 检测血液中的ctDNA越来越 被重视， 得到了飞速发展。 ctDNA是肿瘤细胞凋亡或坏死时释放到血液中的DNA， 被降解为 160‑180bp的游离DNA片段， 含有原始肿瘤细胞的突变状态。 与肿瘤组织样 本相比， 采集外周 血比较方便、 创伤小， 而且可以多次， 另外检测ctDNA可以克服由于肿 瘤异质性导致的组织 检测不准确的问题。 大量研究结果表明两种样 本的检测具有高度的一致性， 说明检测ctDNA 是可以替代组织或作为组织检测的补充。 检测ctDNA 不但能用于突变检测和用药指导， 而且 能够用于疗效跟踪、 耐药监测 和预后， 甚至 于早期筛查和诊断等方面。 [0004]目前基因突变检测方法主要有荧光定量PCR、 二代测序NGS和数字PCR三大类。 ctDNA在血浆cfDNA中的含量大多处于1％以下， 因此对检测技术要求非常高。 数字PCR是第 三代PCR技术， 可实现核酸分子的绝对定量， 并具有极高的检测 灵敏度， 可小于0.1％， 因此 非常适用于血 液中ctDNA的EGFR、 KRAS等基因重要突变位 点的检测。 [0005]19del突变是EGFR  19号外显子上的一段区域发生频繁的缺失突变现象， 缺失类型 多样， 多达几十种。 虽然基于数字PCR检测EGFR  19del突变已有多种方法， 但是一种更简便 准确的检测方法需要 进一步发掘。 发明内容 [0006]发明目的： 针对现有技术存在的问题， 本发明目的是提供一种基于数字PCR检测 EGFR 19del的引物探针组合、 试剂盒和检测方法， 本发 明基于竞争性结合探针的设计原理， 具有操作简便， 结果准确直观， 可应用于组织和cfDNA等样本的检测， 具有很高的灵敏度和 特异度。 [0007]技术方案： 为了 达到上述发明目的， 本发明所采用的技 术方案如下： [0008]一种基于数字PCR检测EGFR  19del的引物探针组合物， 其特征在 于， 所述组合物包 括如下所示的一对特异性引物和一对竞争性结合探针：说　明　书 1/4 页 3 CN 114908086 A 3