(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210484037.0 (22)申请日 2022.05.06 (71)申请人 山东康华生物医疗科技股份有限公 司 地址 261023 山 东省潍坊市经济开发区月 河路699号 申请人 青岛汉唐生物科技有限公司 (72)发明人 杨帆　侯万乐　侯洁　田永帅　 刘嘉男　刘万建　宋金铃　左雪梅　 (74)专利代理 机构 潍坊盛润知识产权代理事务 所(普通合伙) 37299 专利代理师 李光林 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 检测犬立克次氏体和犬埃立克体的引物探 针组合物、 试剂盒及其制备方法 (57)摘要 本发明提供了检测犬立克次氏体和犬埃立 克体的引物探针组合物、 试剂盒及其制备方法， 引物探针组合物： 包括用于检测犬立克次氏体的 引物、 用于检测犬立克次氏体的探针、 用于检测 犬埃立克体的引物、 用于检测犬埃立克体的探 针、 外标引物和外标探针。 可同时检测犬立克次 氏体和犬埃立克体， 并具有良好的灵敏性和特异 性。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图3页 CN 114934043 A 2022.08.23 CN 114934043 A 1.检测犬立克次氏体和犬埃立克体的引物探针组合物， 其特征在于： 包括用于检测犬 立克次氏体的引物、 用于检测犬立克次氏体的探针、 用于检测犬埃立克体的引物、 用于检测 犬埃立克体的探针、 外标引物和外标探针； 所述用于检测犬立克次氏体的引物具有如SEQ   ID NO .1和SEQ ID NO .2所示的核苷酸序列； 所述用于检测犬立克次氏体的探针具有如 SEQ ID NO .3所示的核苷酸序列； 所述用于检测犬埃立克体的引物具有如SEQ  ID NO .4和 SEQ ID NO .5所示的核苷酸序列； 所述用于检测犬埃立克体的探针具有如SEQ  ID NO .6所 示的核苷酸序列； 所述外标引物具有如SEQ  ID NO .7和SEQ ID NO .8所示的核苷酸序列； 所述外标探针具有如SEQ  ID NO .9所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的检测犬立克次氏体和犬埃立克体的引物探针组合物， 其特征 在于： 所述用于检测犬立克次氏体的探针使用的报告基团为FAM荧光基团， 猝灭基团为BHQ1 基团； 所述用于检测犬埃立克体的探针使用的报告基团为 ROX荧光基团， 猝灭基团为BHQ2基 团； 所述外标探针使用的报告基团为VIC荧 光基团， 猝灭基团为BHQ1基团。 3.检测犬立克次氏体和犬埃立克体的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒包括具有如SEQ   ID NO .1‑ SEQ ID NO .9所示核苷酸序列的引物探针组合、 PCR扩增缓冲液、 阳性对照和阴 性对照。 4.根据权利要求3所述的检测犬立克次氏体和犬埃立克体的试剂盒的制备方法， 其特 征在于： 包括设计引物探针组合： 针对犬立克次氏体的gltA基因， 设计用于检测犬立克次氏 体的上游引物序列如SEQ  ID NO .1所示、 下游引物序列如  SEQ ID NO .2所示、 探针序列如 SEQ ID NO .3所示； 针对犬埃立克体的16s  rDNA基因， 设计用于检测犬埃立克体的上游引 物序列如SEQ  ID NO .4所示、 下游引物序列如SEQ  ID NO .5所示、 探针序列如SEQ  ID NO  .6所示； 针对拟南芥SUC2基因， 设计外标的上游引物序列如SEQ  ID NO .7所示、 下游引物序 列如SEQ ID NO .8所示、 探针序列如SEQ  ID NO .9所示。 5.根据权利要求4所述的检测犬立克次氏体和犬埃立克体的试剂盒的制备方法， 其特 征在于： 所述制备方法还包括构建 qPCR扩增反应体系； 所述构建 qPCR扩增反应体系： 以重组 质粒为模板， 进行qPCR扩增反应， 犬立克次氏体重组质粒和犬埃立克体重组质粒的梯度浓 度为1.0×107‑  1.0×103 copies/mL， 外标重组质粒的浓度为1.0 ×105 copies/mL。 6.根据权利要求5所述的检测犬立克次氏体和犬埃立克体的试剂盒的制备方法， 其特 征在于： 所述构建qPCR扩增反应 体系： qPCR扩增反应的25 μL反应 体系为：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114934043 A 2。 7.根据权利要求5所述的检测犬立克次氏体和犬埃立克体的试剂盒的制备方法， 其特 征在于： 所述构建反应程序： qPCR扩增反应程序为： 温度50℃， 时间  2min， 循环1次； 温度95 ℃， 时间 10min， 循环1次； 之后扩增45个 循环， 每个循环94℃变性15s， 6 0℃退火延伸40s。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114934043 A 3