(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221048979 2.8 (22)申请日 2022.05.07 (71)申请人 厦门健康工程与创新研究院 地址 361000 福建省厦门市海沧区后祥路 71号厦门生物医药产业协同创新创业 中心23号楼第8层0 3单元 (72)发明人 洪晗露　白佳委　雷洋　汪大明　 (74)专利代理 机构 厦门仕诚联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 35227 专利代理师 程劲竹 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于荧光RPA 技术检测非洲猪瘟病毒的 引物组和探 针、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本申请适用于非洲猪瘟病毒检测技术领域， 提供了一种基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒 的引物组和探针， 所述引物组包括正向引物RPA ‑ F和反向引物RPA ‑R； 所述正向引物RPA ‑F序列： GCCGAAGGGAA TGGATACCGAGGGAATAGC， 所述 反向引 物 R P A ‑R 序 列 ：C T T A C C G A T G A A A A TG ATACG CAGCG AACG ， 所述探针 序列 ： TCCAGATACGTTGCGTCCGTAATAGGAGTAA(FAM ‑dT) (THF)(BHQ1‑dT)CTTGTTTACCTGCTG ‑SpacerC3。 本 申请还提供了一种基于荧光RPA技术检测非洲猪 瘟病毒的试剂盒及检测方法。 本申请所提供的引 物组和探针以及试剂盒和检测方法对非洲猪瘟 病毒具有高的特异性和高的检测灵敏度， 检测条 件易实现， 检测速度快的特 征。 权利要求书1页 说明书6页 CN 114891925 A 2022.08.12 CN 114891925 A 1.一种基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病 毒的引物 组和探针， 其特征在于， 包括引物 组 和探针， 所述引物组包括 正向引物RPA ‑F和反向引物RPA ‑R； 所述正向引物RPA ‑F序列： GCCGAAGGGAATGGATACCGAGGGAATAGC 所述反向引物RPA ‑R序列： CTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGA ACG 所述探针序列： TCCAGATACGTTGCGTCCGTAATAGGAGTAA(FAM ‑dT)(THF)( BHQ1‑dT)CTTGTTTACCTGCTG ‑ SpacerC3。 2.根据权利要求1所述的引物 组和探针， 其特征在于， 所述引物 组和所述探针的总扩增 产物的大小为28 8bp。 3.一种基于荧光RPA技术检测 非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1或 者2的引物组和探针。 4.根据权利要求3所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的试剂盒， 其特征在于， 还包括荧光基础缓冲液、 无核酸酶水和醋酸镁。 5.一种基于荧 光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特 征在于， 包括： 制备引物组和探针， 所述引物组包括 正向引物RPA ‑F和反向引物RPA ‑R； 所述正向引物RPA ‑F序列： GCCGAAGGGAATGGATACCGAGGGAATAGC 所述反向引物RPA ‑R序列： CTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGA ACG 所述探针序列： TCCAGATACGTTGCGTCCGTAATAGGAGTAA(FAM ‑dT)(THF)(BHQ1 ‑dT)CTT GTTTACCTGCTG ‑ SpacerC3； 提取待测样本的DNA作为模板， 制备反应 体系进行RPA快速扩增 和实时荧 光检测。 6.根据权利要求5所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特征在 于， 所述反应体系为50 μL， 所述反应体系的制备包括： 向反应管中加入浓度为10 μM的正向引 物2.1 μL、 浓度为10 μM的反向引物2.1 μL、 浓度为10 μM的探针0.6 μL、 荧光基础缓冲液29.5 μL、 无核酸酶水1 1.2 μL， 混合均匀后， 再加入DNA模板2 μL和醋酸镁2.5 μL。 7.根据权利要求6所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特征在 于， 将制备好的反应 体系置于带有微型光学检测器的荧 光分析仪中， 进行实时荧 光检测。 8.根据权利要求7所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特征在 于， 所述反应 体系的反应温度为37℃。 9.根据权利要求8所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特征在 于， 所述反应 体系的反应时间为15分钟。 10.根据权利要求9所述的基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的检测方法， 其特征在 于， 所述检测方法针对所述非洲猪瘟病毒的p72基因。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891925 A 2一种基于荧光R PA技术检测非洲猪瘟病毒 的引物组和探针、 试 剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本申请属于非洲猪瘟病毒检测技术领域， 尤其涉及一种基于荧光RPA技术检测非 洲猪瘟病毒的引物组和探针、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(ASF)是一种危害家猪和野猪的流行病， 自1920年代在肯尼 亚首次发现 以来， 它在非洲和欧亚大陆迅速传播。 非洲猪瘟具有高度传染性和致命性， 一旦感染， 对养 猪业会带来毁灭性的经济损失。 中国于2018年在 辽宁省报告了第一例非洲猪瘟(ASF)的病 例， 随后在全国爆发了非洲猪瘟(ASF)， 迄今已导致数万头猪死亡。 非洲猪瘟病毒(ASFV)是 非洲猪瘟(ASF)的病原体， 非洲猪瘟(ASF)有着结构复杂的双链DNA， 因此需要将注 意力集中 在非洲猪瘟病原体— —非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测上。 [0003]聚合酶链式反应(PC R)是一种用于放大扩增特定的D NA片段的分子生物学技术， 它 可看作是生物体外的特殊DNA复制， 聚合酶链 式反应(PCR)的最大特点是能将微量的DNA进 行指数扩增。 因而基于聚合酶链式反应(PCR)的诊断方法已广泛应用于非洲猪瘟病毒 (ASFV)的高灵敏度和特异性检测上， 然而其检测过程复杂， 检测程序包括三个步骤： 变性、 退火和延伸， 且在 多个循环中， 需要高度 专业化的设备。 因而， 基于聚合 酶链式反应(PCR)的 诊断方法进 行检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的成本高、 耗时长且不适合在资源有限的实验室甚 至野外广泛应用。 [0004]此外， 目前报道较多的环介导等温扩增(LAMP)技术， 该技术能在等温(60 ‑65℃)条 件下， 短时间(通常是一小时内)内进 行核酸扩增， 是一种 “简便、 快速、 精确、 低价 ”的基因扩 增方法， 也可用于检测非洲猪瘟病毒(ASFV)。 然而， 采用环介导等 温扩增(LAMP)技术检测非 洲猪瘟病毒(ASFV)时， 需要四个或更多的引物， 且引物设计通常很复杂。 [0005]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)， 被称 为是可以替代聚合酶链式反应(PC R)的核酸检 测技术， 其具有检测时间短、 不受检测仪器限制等的优点， 然而， RPA的引物和探针 设计不像 传统的PCR那样成熟， 且检测条件也需要进一步优化。 因而， 设计可行的基于RPA的引物和探 针， 优化基于RPA的检测条件， 对非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速检测具有重大意 义。 发明内容 [0006]本申请的目的在于提供一种基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病毒的引物组和探 针、 试剂盒及检测方法， 该引物组和探针对非洲猪瘟病毒具有高的特异性和高的检测灵敏 度， 检测条件易实现， 检测速度快。 [0007]为实现上述目的， 第一方面， 本申请提供了一种基于荧光RPA技术检测非洲猪瘟病 毒的引物组和探针， 包括引物组和探针， 所述引物组包括正向引物RPA ‑F和反向引物RPA ‑R； 所述正向引物RPA ‑F序列： [0008]GCCGAAGGGAATGGATACCGAGGGAATAGC， 所述反向引物RPA ‑R序列：说　明　书 1/6 页 3 CN 114891925 A 3