(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210502361.0 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 上海速创诊断产品有限公司 地址 201318 上海市浦东 新区紫萍路908弄 9号楼 申请人 上海速芯生物科技有限公司 (72)发明人 方雪恩　李杨　李亚南　刘闯　 孔继烈　 (74)专利代理 机构 北京林达刘知识产权代理事 务所(普通 合伙) 11277 专利代理师 刘新宇　李茂家 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/22(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/385(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/36(2006.01) C12R 1/66(2006.01) C12R 1/64(2006.01) (54)发明名称 检测脓毒症病原体的引物组合物、 及其核酸 检测试剂盒、 检测方法 (57)摘要 本发明公开了检测脓毒症病原体的引物组 合物、 及其核酸检测试剂盒、 检测方法。 其中， 本 发明公开了检测脓毒症病原 体的引物组合物， 其 包括金黄色葡萄球菌引物组、 肺炎克雷伯菌引物 组、 大肠埃希氏菌引物组、 粪肠球菌引物组、 鲍曼 不动杆菌引物组、 铜绿假单胞菌引物组、 嗜麦芽 窄食单胞菌引物组、 肺炎链球菌引物组、 脑膜炎 奈瑟菌引物组、 曲霉菌引物组、 阴沟肠杆菌引物 组和B族链球菌引物组中的至少一组。 本发明提 供的检测脓毒症病原体的引物组、 包含所述引物 组的核酸检测试剂盒及检测方法， 可快速、 准确 地检测各种脓毒症病原体， 以弥补现有针对脓毒 症病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷， 提高 检测灵敏度和特异性， 降低劳动强度， 缩短检测 周期。 权利要求书2页 说明书16页 序列表14页 附图3页 CN 114807399 A 2022.07.29 CN 114807399 A 1.一种检测脓毒症病原体的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物包括金黄色葡 萄球菌引物组、 肺炎克雷伯菌引物组、 大肠埃希氏菌引物组、 粪肠球菌引物组、 鲍曼不动杆 菌引物组、 铜 绿假单胞菌引物组、 嗜麦芽窄食单胞菌引物组、 肺炎链球菌引物组、 脑膜炎奈 瑟菌引物组、 曲霉菌引物组、 阴沟肠杆菌引物组和B族链球菌引物组中的至少一组； 其中， 所述金黄色葡萄球菌引物组包括SEQ  ID NO:1至SEQ  ID NO:5所示的引物； 所述肺炎克 雷伯菌引物组包括SEQ  ID NO:6至SEQ  ID NO:10所示的引物； 所述大肠埃希氏菌引物组包 括SEQ ID NO:11至SEQ  ID NO:15所示的引物； 所述粪肠球菌引物组包括SEQ  ID NO:16至 SEQ ID NO:20所示的引物； 所述鲍曼不动杆菌引物组包括SEQ  ID NO:21至SEQ  ID NO:25所 示的引物； 所述铜绿假单胞菌引物组包括SEQ  ID NO:26至SEQ  ID NO:30所示的引物； 所述 嗜麦芽窄食单胞菌引物组包括SEQ  ID NO:31至SEQ  ID NO:34所示的引物； 所述肺炎链球菌 引物组包括SEQ  ID NO:35至SEQ  ID NO:39所示的引物； 所述脑膜炎奈瑟菌引物组包括SEQ   ID NO:40至SEQ  ID NO:45所示的引物； 所述曲霉菌引物组包括SEQ  ID NO:46至SEQ  ID NO: 51所示的引物； 所述阴沟肠杆菌引物组包括SEQ  ID NO:52至SEQ  ID NO:57所示的引物； 所 述B族链球菌引物组包括SEQ  ID NO:58至SEQ  ID NO:62所示的引物。 2.根据权利要求1所述的检测脓毒症病原体的引物组合物， 其进一步包括用于扩增内 标片段的对照引物组， 所述对照引物组包括SEQ  ID NO:63～SEQ ID NO:66所示的引物。 3.一种环介导等温扩增试剂， 其包括权利要求1或2所述的引物组合物中的任一引物 组， 以及dNTP、 牛 血清白蛋白、 MgSO4、 荧光染料、 甜菜碱和链置换 型DNA聚合酶。 4.根据权利要求3所述的环介导等温扩增试剂， 其中， 所述链置换型DNA聚合酶为Bst   DNA聚合酶。 5.一种脓毒症病原体核酸检测试剂盒， 其包括微流控芯片和核酸提取试剂， 其中所述 微流控芯片的反应孔中包埋有如权利要求3或4所述的环介导 等温扩增试剂。 6.根据权利要求5所述的脓毒症病原体核酸检测试剂 盒， 其中， 所述环介导等温扩增试 剂通过以下 方式包埋在所述 微流控芯片的反应孔中： 采用针式芯片点样仪， 将针对不同病原体的环介导等温扩增试剂分别点样在微流控芯 片的不同的反应孔中； 将点样后的微流控芯片放入真空干燥箱中， 在室温下， 在50～100Pa的真空条件下， 干 燥10～30分钟， 环境湿度在40～6 0％。 7.根据权利要求5或6所述的脓毒症病原体核酸检测试剂盒， 其中， 所述微流控芯片包 含多个反应孔， 分别包埋有含金黄 色葡萄球菌引物组、 肺炎克雷伯菌引物组、 大肠埃希氏菌 引物组、 粪肠球菌引物组、 鲍曼不动杆菌引物组、 铜 绿假单胞菌引物组、 嗜麦芽窄食单胞菌 引物组、 肺炎链球菌引物组、 脑膜炎奈瑟菌引物组、 曲霉菌引物组、 阴沟肠杆菌引物组或B 族 链球菌引物组的环介导 等温扩增试剂； 可选地， 所述微流控芯片还包括包埋有含对照引物组的环介导等温扩增试剂的反应 孔； 和/或， 所述 微流控芯片还 包括包埋有不含引物组的环介导 等温扩增试剂的反应孔。 8.一种非治疗和诊断目的的脓毒症病原体检测方法， 其采用如权利要求5～7中任一项 所述的脓毒症病原体核酸检测试剂盒， 包括以下步骤： 样本中核酸提取及纯化： 将样本在8000～15000rpm， 离心2～8min， 弃上清后， 每200μL 原始样本， 添加5 0～150 μL核酸提取试剂， 混匀后添加至微 流控芯片的加样孔中；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807399 A 2环介导等温扩增： 将添加样本的微流控芯片转移至全自动恒温核酸扩增分析仪中， 在 90～98℃加热2～7min后， 在1000～5000rpm下离心， 使得样本由加样孔流入 各反应孔中， 在 60～65℃下扩增3 0～45min； 结果判定： 根据全自动核酸恒温分析仪的检测结果判断样本中是否含有脓毒症病原 体。 9.根据权利要求8所述的脓毒症病原体核酸方法， 其中， 在所述样本 中核酸提取及纯化 前， 还包括样本的预 处理的步骤， 其包括将样 本中加入样 本体积2～ 4倍体积的1～2M的氢氧 化钠溶液， 涡旋震荡1～5min后静置2～30min， 在8000～15000rpm条件下， 离心3～8min， 去 上清， 加入生理盐水震荡清洗， 在80 00～15000rpm条件下， 离心3～8mi n， 去上清， 待用。 10.权利要求1或2所述的引物组合物、 权利要求3或4所述的环介导等温扩增试剂在制 备用于诊断脓毒症的试剂或试剂盒中的用途； 其中， 所述脓毒症是由金黄色葡萄球菌、 肺炎克雷伯菌、 大肠埃希氏菌、 粪肠球菌、 鲍曼 不动杆菌、 铜绿假单胞菌、 嗜麦芽窄食单胞菌、 肺炎链球菌、 脑膜炎奈瑟菌、 曲霉菌、 阴沟肠 杆菌和/或B族链球菌引起的脓毒症。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807399 A 3