(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210498674.3 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 中国检验检疫科 学研究院 地址 100163 北京市大兴区经济技 术开发 区荣华南路11号院 (72)发明人 陈颖　邢冉冉　刘珂涵　于宁　 张九凯　邓婷婷　 (74)专利代理 机构 北京天盾知识产权代理有限 公司 11421 专利代理师 丁敬博 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) G16B 30/10(2019.01) G16B 30/20(2019.01) (54)发明名称 一种基于DNA条形码的溯源 标识物及其制备 方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于DNA条形码的溯源 方 法， 该方法包括快速检测法或者测序鉴定法， 其 包括如下步骤： 依据溯源DNA条形码编写原则， 设 计合成特定的DNA和保密引物， 构建携带DNA条形 码的质粒作为溯源标识物微粒； 在溯源样本加工 环节添加所述溯源标识物微粒； 建立包含所述溯 源样本、 所述DNA条形码、 所述保密引物， 与所述 溯源样本溯源源头信息和/或批次物 流信息对应 关系的数据库备查； 从溯源对象中分离溯源 标识 物， 鉴定标注溯源信息的真实性。 本发明的溯源 方法标识性强， 准确性高， 充分利用了DNA的信息 承载力和鉴定特异性， 能够实现对目标物的有效 辨识和精 准追溯， 为维护企业与消费者利益以及 正常的市场秩序提供技 术支撑。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图3页 CN 114875120 A 2022.08.09 CN 114875120 A 1.一种基于DNA条形码的溯源方法， 其特征在于， 该溯源方法为快速检测法， 所述快速 检测法包括如下步骤： (1)依据溯源DNA条 形码编写原则确定DNA条 形码序列信息； (2)根据DNA条形码序列信息设计合成特定的DNA和保密引物， 构 建携带DNA条形码的质 粒作为溯源标识 物， 用铵功能化 二氧化硅微粒包埋溯源标识 物， 得到溯源标识 物微粒； (3)在溯源样本加工环 节添加所述溯源标识 物微粒； (4)建立包含所述溯源样本、 所述DNA条形码、 所述保密引物， 与所述溯源样本溯源源头 信息和/或批次物流信息对应关系的数据库备查； (5)从溯源对象中分离溯源标识物， 在 保密引物参与下对溯源标识物中的DNA条形码进 行跨越式滚环等温扩增， 鉴定标注溯源信息的真实性。 2.一种基于DNA条形码的溯源方法， 其特征在于， 该溯源方法为测序鉴定法， 所述测序 鉴定法包括如下步骤： (1)依据溯源DNA条 形码编写原则确定DNA条 形码序列信息； (2)根据DNA条形码序列信息设计合成特定的DNA和保密引物， 构 建携带DNA条形码的质 粒作为溯源标识 物， 用铵功能化 二氧化硅微粒包埋溯源标识 物， 得到溯源标识 物微粒； (3)在溯源样本加工环 节添加所述溯源标识 物微粒； (4)建立包含所述溯源样本、 所述DNA条形码、 所述保密引物， 与所述溯源样本溯源源头 信息和/或批次物流信息对应关系的数据库备查； (5)从溯源对象中分离溯源标识物， 在 保密引物参与下对溯源标识物中的DNA条形码进 行跨越式滚环等温扩增， 鉴定标注溯源信息的真实性； (6)对于溯源成功的溯源对象， 针对溯源标识物进行测序， 获得DNA条形码片段的序列 信息， 使用DNA条形码片段的序列信息在数据库的溯源信息索引表格中查询， 获取DNA条形 码溯源信息； 如果溯源标识物所对应的源头信息和/或批次物流信息可以完整读取， 则溯源 成功。 3.根据权利要求1或2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中合成特定DNA的PCR 引物序列如SEQ  ID NO.2和SEQ  ID NO.3、 或者SEQ  ID NO.5和SEQ  ID NO.6、 或者SEQ  ID  NO.10和SEQ  ID NO.11所示。 4.根据权利要求1或2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中构建携带DNA条形 码的质粒的方法如下： 将DNA条形码接入质粒， 对携带成功接入完整DNA条形码质粒的感受 态细胞进行扩增， 通过质粒提取进行富 集， 得到溯源标志 物。 5.根据权利要求1或2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(2)中用铵功能化二氧化 硅微粒包埋溯源标识物的方法如下： 制备二氧化硅微粒， 将二氧化硅微粒进行铵功 能化处 理， 溯源标识 物包埋于铵功能化 二氧化硅微粒中， 即得。 6.根据权利要求1或2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(3)包括以下步骤： 在溯 源样本加工环节， 按照确定的比例在溯源样本中添加该样本对应的溯源标识物微粒； 或者 在溯源样本包 装上添加该样本对应的溯源标识 物微粒。 7.根据权利要求1或2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(5)包括以下步骤： 从溯 源对象中取样或者从溯源对 象包装上做无污染取样， 从取样 中分离溯源标识物； 根据样本 溯源源头信息和/或批次物流信息在数据库中获得对应的保密引物， 在保密引物参与下对权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114875120 A 2分离的DNA条 形码进行跨越式滚环等温扩增， 完成对样本标注溯源信息的真实性 鉴别。 8.根据权利 要求2所述的溯源方法， 其特征在于， 所述步骤(6)中获得DNA条形码片段的 序列信息的方法如下： 将得到的序列利用DNASART软件中的Seq  Man功能进行序列拼接， 将 拼接好的序列经过ME GA6.0软件进行多序列比对， 去掉序列两端的低质量区； 处理好的序列 依据pMDTM19‑T载体说明书定位DNA条 形码插入位点， 读取溯源信息 。 9.一种用于产品产地溯源的溯源标识物微粒， 其特征在于， 包括溯源标识物以及用于 包埋溯源标识物的铵功能化二氧化硅微粒， 所述溯源标识物为携带DNA条形码的质粒， 所述 DNA条形码序列如SEQ  ID NO.1或SEQ  ID NO.4或SEQ  ID NO.9所示， 所述铵功能化二氧化硅 微粒是将二氧化硅微粒用N ‑三甲氧基硅烷基丙基 ‑N,N,N‑三甲基氯化铵 溶液进行铵功能化 处理后得到的微粒。 10.权利要求9所述溯源标志 物微粒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)将DNA条形码接入质粒， 对携带成功接入完整DNA条形码质粒的感受态细胞进行扩 增， 通过质粒提取进行富 集， 得到溯源标志 物； (2)制备二氧化硅微粒， 将二氧化硅微粒进行铵功能化处理， 溯源标识物包埋于铵功能 化二氧化硅微粒中， 即得。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114875120 A 3