(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210500946.9 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 北京林业大 学 地址 100083 北京市海淀区清华 东路35号 (72)发明人 陶静　焦继鹏　任利利　宗世祥　 骆有庆　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测松针鞘瘿蚊的种特异性LAMP引物及其 应用 (57)摘要 本发明涉及分子检测技术领域， 具体涉及检 测松针鞘瘿蚊的种特异性LAMP引物及其应用。 本 发明所提供的松针鞘瘿蚊种特异性LAMP引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑4所示。 本发明还提 供了一种检测松 针鞘瘿蚊的方法， 能够在短时间 内快速、 准确地进行重大林业检疫性害虫松针鞘 瘿蚊的鉴定， 特别是除成虫和老熟幼虫以外其它 虫态(卵、 低龄幼虫和蛹)的鉴定， 本发明所提供 的方法可用于国内外苗木调运等检疫工作中松 针鞘瘿蚊的快速 检测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表15页 附图5页 CN 114854875 A 2022.08.05 CN 114854875 A 1.松针鞘瘿蚊种特异性LAMP引物， 其特征在于， 所述松针鞘瘿蚊种特异性LAMP引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑4所示。 2.权利要求1所述的松针鞘瘿蚊种特异性LAMP引物在制备松针鞘瘿蚊检测试剂 盒中的 应用。 3.一种松针鞘瘿蚊的检测试剂盒， 其特征在于， 含有核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑4所示 的松针鞘瘿蚊种特异性 LAMP引物。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒中， 还包括变色预 混液。 5.权利要求3 ‑4任一项所述的检测试剂盒在可视化检测松针鞘瘿蚊中的应用。 6.一种检测松针鞘瘿蚊的方法， 其特征在于， 以待测样本的DNA为模板， 利用如SEQ  ID  NO.1‑4所示的松针鞘瘿蚊种特异性 LAMP引物进行扩增。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 以待测样本的DNA为模板， 利用权利要求4 所述的检测试剂盒进行松针鞘瘿蚊的检测。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 以体积比计， 所述扩增的反应体系中， 变色 预混液： SEQ  ID NO.1‑2： SEQ ID NO.3‑4为25： 8:1。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述扩增的反应条件为61℃恒温扩增 60min。 10.根据权利要9所述的方法， 其特征在于， 检测结果的判断标准为： 含有松针鞘瘿蚊的 样本， 扩增后反应体系由红色变为黄色； 不含松针鞘瘿蚊的样本， 扩增后反应体系保持红 色。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854875 A 2检测松针鞘瘿蚊的种特异性LAMP引物及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子检测技术领域， 具体涉及检测松针鞘瘿蚊的种特异性LAMP引物及 其应用。 背景技术 [0002]松针鞘瘿蚊Thecodiplosis  japonensis属于双翅目(Diptera)瘿蚊科 (Cecidomyiidae)鞘瘿蚊属(Thecodiplosis)， 异名： T.pinicola， 英文名为Pine  needle  gall midge。 松针鞘瘿蚊是危害黑松、 赤松和油松的一种小型昆虫， 体长2.5 ‑3mm。 该虫属初 期性害虫， 以幼虫匿居于松针基部吸食汁液为害寄主， 导致针叶基部膨大形成虫瘿， 受害松 针明显缩短， 逐渐枯黄脱落， 严重影响松树正常生长。 被其危害后植株树势衰弱、 易被次期 性害虫危害， 并导 致植株死亡； 严重危害时单独也可在当年 危害松树 致死。 [0003]研究表明， 松针鞘瘿蚊可危害多种松属植物。 被危害松针基部产生瘿瘤的寄主多 属于欧洲赤松亚派， 包括： 脂松P.resinosa， 欧洲黑松P.nigra， 欧洲山松P.mugo， 岛松 P.insularis， 美国大果松P.cou lteri， 欧洲赤松P.sylvestri s， 琉球松P.luchuen sis， 辐射 松(澳洲、 南非)P.radiata， 黄山松P.taiwanensis， 日本黑松P.thunbergii， 马尾松 P.massoniana， 赤松P.densiflora和油松P.tabulaeformi s。 根据CLIMEX模型和MaxEnt生态 位模型预测显示， 我国南方大部分省份为其的潜在地理分布 区， 因此松针鞘瘿蚊对南方松 林具有潜在危害性。 [0004]植物检疫， 是防止外来有害生物入侵和扩散 的最有效的手段。 为了将松针鞘瘿蚊 和国内常见瘿蚊类昆虫区分开来， 需要大量形态学鉴别工作， 目前瘿蚊类昆虫 的形态鉴定 主要依据成虫翅脉和老熟幼虫剑骨片的形态差异， 这些鉴定方法需要复杂的样本处理工 序， 且需要专业的昆虫分类学知识。 并且， 处于卵、 低龄幼虫和蛹这三个虫态的瘿蚊类昆虫 在形态上非常相似， 目前还没有可靠的鉴定特 征。 [0005]近些年， 越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。 线粒体DNA严格母性遗传， 其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守， 结构稳定， 无 内含子的特点。 因此， 常用于物种分类、 鉴定和亲缘关系的研究。 也有针对松针鞘瘿蚊C OI基 因序列设计了特异 性引物对其进 行分子鉴定的报道， 但 这种SS‑COI方法需要P CR仪、 核酸电 泳仪等设备， 适用于专业机构的检测。 本发明将提出一种简易的检测方法。 [0006]环介导等温扩增技术(LAMP)依赖于4条特异性引物和一种具有链置换活性 的DNA 聚合酶(BstDNA聚合 酶)， 可在等 温条件下高效、 快速、 特异 性地扩增靶序列。 反应结束后， 只 需要用肉 眼观察就能鉴定扩增与否， 而且LAMP反应所用设备简单、 花费少， 又能满足快速检 测的需要， 在 核酸的科学研究、 疾病的诊断和预防、 动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测 等领域得到 了日益广泛的应用。 发明内容 [0007]本发明的目的是提供一种快速可视化鉴别松针鞘瘿蚊的方法， 可以在短时间内快说　明　书 1/6 页 3 CN 114854875 A 3