(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210500206.5 (22)申请日 2022.05.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114592066 A (43)申请公布日 2022.06.07 (66)本国优先权数据 202111439557.1 2021.1 1.30 CN (73)专利权人 杭州翱锐 基因科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市经济技 术开发 区6号大街26 0号18幢3 01室 (72)发明人 张琼　朱友杰　徐博　 (74)专利代理 机构 杭州天昊专利代理事务所 (特殊普通 合伙) 33283 专利代理师 向庆宁　曹小燕(51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6827(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/573(2006.01) 审查员 贾星航 (54)发明名称 一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志 物及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种新型多靶点肝癌早期检 测的组合标志物及其应用， 通过从肝癌组织、 癌 旁组织、 肝炎患者样本的高深度全基因组甲基化 （WGBS） 数据中找到了系列新型的、 能高效区分肝 癌和肝炎患者的甲基化位点， 可用于早期肝癌的 高效检测； 将该新型基因甲基化位点与其他肝癌 检测标志物 （如AFP、 AFP ‑L3和DCP） 组合， 能进一 步提高AUC值， 提高早期肝癌筛查的灵敏度和特 异性。 权利要求书1页 说明书18页 序列表23页 附图3页 CN 114592066 B 2022.08.19 CN 114592066 B 1.检测标志物组合的试剂用于制备早期肝癌检测试剂的用途， 其特征在于， 所述标志 物组合包括序列表Seq  ID NO.1~Seq ID NO.33所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组 合。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 所述标志物组合还包括蛋白标志物， 所述蛋 白标志物包括AFP、 DCP和AFP ‑L3。 3.一种用于检测如权利要求1所述用途中的标志物 组合的引物组合， 其特征在于， 所述 引物组合包括如下表所示的3 3组引物、 探针： 4.一种用于检测早期肝癌的试剂 盒或芯片， 其特征在于， 包括如权利要求3所述的引物 和探针组合。 5.一种用于检测早期肝癌的标志物组合， 其特征在于， 包括如序列表Seq  ID NO.1~Seq  ID NO.33所示的序列。 6.如权利要求5所述的标志物组合， 其特征在于， 还包括蛋白标志物， 所述蛋白标志物 包括AFP、 DCP和AFP ‑L3。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114592066 B 2一种新型多靶点肝癌早期检测的组合标志物及其应用 [0001]本申请主张中国在先申请， 申请号： 202111439557.1， 申请日2021年11月30日的优 先权； 其所有的内容作为本发明的一部分。 技术领域 [0002]本发明涉及癌症早期筛查领域， 具体而言， 涉及一种新型多靶点肝癌早期检测的 组合标志 物及其应用。 背景技术 [0003]肝癌是60岁以下男性人群中最常见的肿瘤和主要癌症致死原因。 近年来， 我国的 肝癌诊疗技术取得了较大进步， 但 年龄标化后的患者总体5年净生存率仅由2000 ‑2004年间 的11.7%提高到2010 ‑2014年间的14.1%， 未见显著提高。 然而， 接受根治性治疗的巴塞罗那 肝癌临床分期 （BCLC） 0或A期肝癌患者， 其5年总生存率可高达69.0%~86.2%。 因此， 肝癌的早 发现和早治疗是提高肝癌总体生存率的关键 。 [0004]目前而言， 肝癌最主要的筛查手段是通过甲胎蛋白 （A FP） 进行检测， 对于高风险人 群再通过超声、 核磁等影像学手段进一步检查。 对于可疑病灶时， 用于确诊的金标准手段是 肝穿刺活检。 然而上述三种检测 手段都各有其局限性， 根据文献报道， 在检测特异性为95% 时， 甲胎蛋白 （AFP） 检测的灵敏度为45%。 超声检测灵敏度有限， 同时也不能用于确诊。 作为 诊断金标准的肝穿刺活检则不仅有很大的侵入性， 且有引起肿瘤 扩散的风险。 不仅如此， 由 于肿瘤有普遍的肿瘤内异质性存在， 导 致很多时候 肝穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌 。 [0005]基于循环肿瘤DNA （circulat ing tumor DNA， ctDNA） 检测的液体活检技术， 由于其 无创、 实时、 灵敏的特点， 使之成为癌症 早筛的主要检测方法， 其中ctDNA的甲基化指标凭借 组织溯源、 增强信噪比、 特征位点数量多等优势是癌症早筛的理想标志物。 Kisiel等人 (Hepatology,  2019, 69(3): 1180‑1192)一项针对9 5名肝细胞癌 （HCC） 患者和51名肝硬化 对照的研究表明， 甲基化DNA标记物组对小于2c m的孤立性HCC的诊断灵敏度为75%。 Cai等人 (Gut, 2019, 68(12): 2195‑2205)建立了一组由32个与HCC、 HB V或肝纤维化有关的基因组 成的甲基化panel， 他们利用加 权模型和上述甲基化panel能够有效地将HCC与慢性肝炎或 肝硬化区分开来。 在220名早期HCC与129名对照的验证队列研究中(Clinical  Cancer  Research, 2019, 25(17): 5284‑5294)， 诊断模型在区分早期HCC与HB V或肝硬化对照患者 方面的灵敏度为83%， 特异性为67%。 但是现有的甲基化位点的检测早期肝癌的AUC值普遍偏 低， 灵敏度和特异 性不高， 并不能很好地区分肝癌和肝炎患者， 依然还需要通过进一步地检 查才能确诊。 [0006]另一方面， 由于技术的局限性， ctD NA 甲基化检测性能也有一定的天花板， 结合基 因组学、 表观遗传学、 蛋白质组学等多组学指标已成为发展趋势。 已有多个临床研究表明， 多组学标志物检测的敏感性和特异 性优于单一组学标志物。 2020年4月， Thr ive联合了约翰 霍普金斯大学、 格伊辛格卫生医疗系统， 在Science杂志首次公布了Cancer  SEEK的一项临 床试验 （DETECT ‑A） 研究的结果(Scienc e, 2020. 369(6499))。 通过将血液筛查和PET ‑CT筛说　明　书 1/18 页 3 CN 114592066 B 3