(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210502156.4 (22)申请日 2022.05.09 (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上 大路99号 (72)发明人 祁巍巍　石园　 (74)专利代理 机构 上海上大专利事务所(普通 合伙) 3120 5 专利代理师 顾勇华 (51)Int.Cl. C12N 15/82(2006.01) C12N 15/29(2006.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/46(2018.01) A01H 1/02(2006.01) A01H 4/00(2006.01)C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种玉米自交系双载体遗传转化系统、 其构 建方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种玉米自交系双载体遗传转 化系统、 其构建方法及其应用， 能优化玉米自交 系遗传转化效率的双载体遗传转化体系的建立， 该体系使难以转化且重要的玉米品系 能进行高 效转化。 该体系首先构建pHB ‑ZmBBM‑ZmWUS诱导 载体和pCAMBIA3301 ‑GFP报告载体,并利用基因 枪轰击结合农杆菌介导法转化玉米自交系， 使玉 米自交系郑58、 PH4CV和Mo17实现转化并获得转 基因植株。 其中， 转基因郑58转化率最高， 且其整 个转化周期仅52天， 比传统转化周期缩短30天。 双载体遗传转化体系的建立大大缩短了转化周 期， 从而有助于玉米优质性状的遗传改良。 权利要求书1页 说明书12页 序列表7页 附图4页 CN 115386589 A 2022.11.25 CN 115386589 A 1.一种玉米自交系双载体遗传转化系统， 其特征在于： 该双载体遗传转化系统包含 pHB‑ZmBBM‑ZmWUS诱导载体和pCAMBIA3301 ‑GFP报告载体， 其中， 在愈伤中胚胎发育调 控因 子(BBM)强表达， 分生组织形态发生因子(WUS)正常表达 。 2.一种权利要求1所述玉米自交系双载体遗传转化系统 的构建方法， 其特征在于： 采用 如下玉米自交系双载体遗传转 化体系的具体培 养流程： 利用基因枪轰击， 结合农杆菌介导法转化玉米自交系， 将双载体导入玉米未成熟胚中， 通过共培养、 恢复培养、 无筛选培养、 预再生培养、 暗再生培养、 光再生培养等过程， 获得转 基因植株。 3.一种权利要求1和2所述玉米自交系双载体遗传转化系统的应用， 其特征在于： 使玉 米自交系郑58、 PH4CV、 Mo17、 昌7 ‑2和B73实现转 化， 并获得转基因植株。 4.一种权利要求1和2所述的双载体遗传转化系统的应用,其特征在于： 玉米转基因阳 性事件后代的鉴定与分离分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386589 A 2一种玉米自交系双载体遗传 转化系统、 其构建 方法及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种优化玉米自交系遗传转化效率的双载体转化体系及其应用， 该体 系使难以转 化且重要的玉米品系能进行高效转 化。 技术背景 [0002]玉米(Zea  mays L.)作为全世界广泛种植的禾本科作物之一， 主要用于粮食、 动物 饲料及各种 行业原料。 随着世界人 口的增长和食品消费的增加， 人们对玉米产量及质量的 需求日夜增大。 玉米分子育种的快速发展， 使得这种需求 成为现实， 尤其遗传转化技术的应 用， 从基因层面 为改良玉米品种 、 保留优势性状及育种提供新策略。 [0003]遗传转化技术中， 组织培养是玉米遗传转化技术的关键环节。 不 同玉米品种的遗 传背景复杂且不同， 玉米基因型也差异很大， 致使不同基因型的再生能力也千差万别。 传统 遗传转化技术已改善许多难以转化的玉米自交系， 但更有价值的自交系的遗传转化问题仍 是巨大的挑战。 借用特异的启动子及新型启动子诱导基因组成型表达， 建立高效的遗传转 化体系， 以期为改良玉米新品种发挥重要的作用。 [0004]植物胚胎细胞从分化出各种组织， 再发育产生根茎叶等各器官； 或由植物体分生 组织直接分化器官再形成植株的过程。 整个植物形态发生的过程受到内在基因协同控制和 外界环境因素 的影响。 近些年， 研究者发现形态发生的相关基因过度表达可刺激转基因植 物的生长， 进 而改善植物遗传转 化。 [0005]BABYBOOM(BBM)是一种形态发生基因， 通过其在发育中的种子中的表达模式和过 度表达表型的结合， 在胚胎发生过程中促进细胞增殖和形态发生。 WUSCHEL(WUS)是调控茎 和花分生组织形态发生的因子， 在维持结构和功能完整性方面起着重要作用。 BBM/WUS的共 表达可成功 诱导高粱未成熟胚、 甘蔗愈伤组织和籼稻愈伤组织获得转基因植株。 然而， 许多 形态发生基因的强烈表达往往导致产生多效性和有害表型， 导致转基因TO植株及其后代的 低生育率。 目前， 有效缓解 这一局面具有挑战性。 发明内容 [0006]本发明的目的之一在于提供一种玉米自交系双载体遗传转化系统的设计和构建 方法。 [0007]本发明的目的之二在于提供一种双载体遗传转化体系 构建的培养流程和应用。 本 发明还提供双载体 体系转基因玉米后代基因型鉴定与分离分析 方法。 [0008]为达到上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0009]一种玉米自交系双载体遗传转化系统， 该双载体遗传转化系统包含pHB ‑ZmBBM‑ ZmWUS诱导载体和pCAMBIA3301 ‑GFP报告载体， 其中， 在愈伤中胚胎发育调控因子(BBM)强表 达， 分生组织形态发生因子(WUS)正常表达 。 [0010]一种本发明所述玉米自交系双载体遗传转化系统的构建方法， 采用如下玉米自交 系双载体遗传转 化体系的具体培 养流程：说　明　书 1/12 页 3 CN 115386589 A 3