(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210511404.1 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 江苏命码生物科技有限公司 地址 225300 江苏省泰州市药城大道1号G 幢(G13) (72)发明人 张辰宇　王延博　管丹萍　蒯健　 (74)专利代理 机构 北京智丞瀚方知识产权代理 有限公司 1 1810 专利代理师 姜司晨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 用于新型冠状病毒中重型、 危重型病例早期 预警的试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于新型冠状病毒中重 型、 危重型病例早期预警的试剂盒， 以及试剂盒 中所使用的特异性引物和探针。 与现有技术相对 比， 本发明具有以下优点： 与现有技术相对比， 本 发明具有以下优点： 本发明所提供的特异性引 物、 探针和试剂盒， 其针对的miR ‑nsp3‑3p以及内 参基因Let ‑7d的引物探针序列特异性好， 无非特 异性扩增， 检测的灵敏性和特异性高； 该标志物 由新冠病毒编码， 本身就是病毒的核酸物质， 因 此具有疾病特异性， 可用于重型、 危重型患者的 诊断和早期预警。 权利要求书1页 说明书20页 附图4页 CN 115478116 A 2022.12.16 CN 115478116 A 1.一种检测miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述miRNA标志物为miR ‑nsp3‑3p， 所 述检测miR ‑nsp3‑3p标志物的引物组中包括第一逆转录引物、 第一PCR上游引物和第一PCR 下游引物， 第一逆转录引物序列如SE  Q ID NO.1所示， 第一PCR上游引物序列如SEQ  ID  NO.2所示， 第一PCR下游引物序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.根据权利要求1所述的一种检测miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述引物组中 还包括用于检测内参基因miRNA标志物 Let‑7d的第二逆转录引物、 第二P CR上游引物和第二 PCR下游引物， 第二逆转录引物序列如SEQ  ID NO.5所示， 第二PCR上游引物序列如SEQ  ID  NO.6所示， 第二PCR下游引物序列如SEQ  ID NO.7所示。 3.根据权利要求2所述的检测多种miRNA标志物的引物组， 其特征在于， 所述引物组中 还包括有分别用于检测miR ‑nsp3‑3p和Let‑7d内参基因的第一探针和第二探针， 第一探针 序列如SEQ  ID NO.4所示， 第二探针序列如SEQ  ID NO.8所示。 4.检测miRNA标志物 的引物组在制备用于新型冠状病毒中重型、 危重型病例早期预警 的试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述检测miRNA标志物的引物组为权利要求1 ‑3任一所述 的引物组。 5.用于新型冠状病 毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 为染料法试剂盒， 所述染料法试剂盒包括有权利要求1 ‑2所述的引物组。 6.用于新型冠状病 毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒 为探针法试剂盒， 所述探针法试剂盒包括有权利要求 1‑2所述的引物组和权利要求3所述的 探针。 7.根据权利要求5或6所述的用于新型冠状病毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 还 包括有PCR反应液、 阳性质控品、 阴性质控品和空白对照。 8.根据权利要求7所述的用于新型冠状病 毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂 盒， 其 特征在于， 所述PCR反应液中， 包含有DEPC水、 qPC R缓冲液、 MgCl2、 核苷酸混合液、 逆转录酶、 DNA聚合酶和染料 试剂。 9.根据权利要求8所述的用于新型冠状病 毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂 盒， 其 特征在于， 所述染料 试剂为ROX参比染料或SYBR  Green荧光染料。 10.权利要求5 ‑9任意一项所述的用于新型冠状病 毒中重型、 危重型病例早期预警的试 剂盒的使用方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.取外周血 血清样本； S2.提取样本的总RNA， 以总RNA为扩增模板； S3.分别配制血清样本、 阳性质控品、 阴性质控品和空白对照的PCR反应 体系； S4.以各PCR反应 体系进行PCR反应； S5.依据PCR反应结果的扩增曲线和Ct值判断待测样本的阴 阳性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115478116 A 2用于新型冠状病毒中重型、 危重型病例早期预警的试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及医疗检测器械技术领域， 具体涉及用于新型冠状病毒中重型、 危重型 病例早期预警的试剂盒。 技术背景 [0002]新冠肺炎的特点之一是患者在感染病毒后 表现出不同的症状， 一部分患者症状轻 微甚至无症状， 而另一部 分患者则会迅速出现急性呼吸窘迫综合征等重型/危重型症状， 最 终造成严重的脏器损伤甚至死亡。 尽早对重症患者采取特殊监护和施加有效治疗手段 （如 肺保护性通气等） ， 对于降低新冠肺炎的死亡率有重要意义。 然而目前对于重症患者诊断的 指标较为复杂繁琐， 需要多项指标联合判断， 这大大增加了医生负担， 造成了较高的漏诊和 误诊现象。 另外， 重症的发生仍缺乏可靠的预警标志物， 难以在初始阶段对轻、 重症患者进 行区分， 往往只能待患者出现重症症状后再进行治疗， 从而错失了最佳的治疗时机。 因此， 筛选新冠感染者中的重症患者， 提前进 行干预和救治， 对于减少新冠肺炎死亡率， 合理分配 医疗资源， 有效控制疫情传播有重要意义。 目前 临床上现有普遍应用的重型/危重型诊断方 法， 需要全套评估气促频率、 指氧饱和度、 动脉血氧分压/吸氧浓度、 肺部影像学、 呼吸衰竭、 休克、 器官衰竭等多个指标， 操作较为繁琐， 给医生临床诊断带来很大困难， 容易造成重症 患者漏诊和错诊。 另一方面， 目前临床上的重型/危重型早期预警指标包括低氧血症、 组织 氧合指标、 外周血淋巴细胞技术、 炎症因子、 D ‑二聚体、 胸部影像学等， 均存在特异 性和敏感 性低的问题； 难以在初始阶段对轻、 重症患者进 行区分， 往往只能待患者出现重症症状后再 进行治疗， 从而错失了最佳的治疗时机。 因此， 为了更好的诊断和早期预警新冠感染重型/ 危重型患者， 就迫切需要更好的生物标记 物。 [0003]MicroRNA （miRNA） 为一类长约19 ‑23个核苷酸的单链小核糖核酸 （RNA） 分子， 位于 基因组非编码区， 进化上高度保守， 通过抑制靶基因mRNA的翻译 过程对基因表达进 行调节， 从而参与包括个体发育、 组织分化、 能量代谢等大部 分生理活动， 也与许多疾病的发生密切 相关。 越来越多的研究发现病毒可以编码和表达miRNA， 目前已有超过100种病毒来源的 miRNA被鉴定出来。 2021年， 南京大学研发团队曾联合其余三家单位在国际知名杂志Cell   Discovery发表论文， 报道了一项关于新冠重症检测的多中心联合研 究。 该研究中， 研 究人 员首先在江苏地区收集的新冠患者血清中鉴定出了一种由新冠病毒编码的micr oRNA‑miR‑ nsp3‑3p， miR‑nsp3‑3p是新冠病毒来源的核酸， 它只存在于重症患者血清中， 在轻症患者和 健康人血清中均检测不到， 提示了该标志物与新冠重症发生有关。 进而， 该团队在某某医院 采集的血清样 本中分别进行了独立验证， 结果表明， 血清miR ‑nsp3‑3p在各个地区的样 本中 均能够准确区分轻、 重症新冠患者， 并且准确率显著高于D ‑二聚体、 C 反应蛋白、 低密度脂蛋 白和淋巴细胞数等传统检验指标。 更重要的是， 通过对轻、 重症患者不同病程阶段、 不同时 间点采集的血样进 行检测分析发现， 在重症患者出现重症症状之前约7.4 天， 就能够在患者 血清中检测到 miR‑nsp3‑3p， 并且随着患者康复该标志物 转为阴性， 轻症患者检测结果则一 直为阴性。 数据表明， 该标志物对重症的预测准确率高达97.1%， 是一种精准预测患者发展说　明　书 1/20 页 3 CN 115478116 A 3