(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210509774.1 (22)申请日 2022.05.11 (71)申请人 武汉爱博泰克生物科技有限公司 地址 430078 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速 器1.1期7栋4层01室 (72)发明人 余乐　程威　程索　李嘉琪　 郭年华　盛鑫龙　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/90(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 硫醇活化细胞溶 血素蛋白的重组表达 (57)摘要 本申请公开了硫醇活化细胞溶血素蛋白的 重组表达， 具体公开了硫醇活化细胞溶血素蛋白 的表达载体、 构建方法、 引物组、 宿主细胞和制备 方法。 本申请能够快速制备无标签的硫醇活化细 胞溶血素蛋白， 简化了无标签重组硫醇活化细胞 溶血素蛋白的制备工艺， 同时可制得纯度超过 90％的重组硫醇活化细胞溶 血素蛋白。 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图4页 CN 114854771 A 2022.08.05 CN 114854771 A 1.硫醇活化细胞 溶血素蛋白的重组表达方法， 包括： 获得编码所述硫醇活化细 胞溶血素蛋白的目的片段， 所述目的片段为SEQ  ID NO.1或2 所示的核苷酸序列； 构建连接有所述目的片段的表达载体； 将所述表达载体转 化至宿主细胞中， 获得表达细胞； 活化和培 养所述表达细胞， 收集培 养液， 并对所述培 养液进行提取和纯化； 对纯化得到的带有标签的所述重组硫醇活化细胞溶血素蛋白进行酶切， 以得到无标签 的所述重组硫醇活化细胞 溶血素蛋白。 2.根据权利要求1所述的制 备方法， 其中， 所述酶切步骤具体包括： 于50mM  Tris‑HCL， 100mM NaCL条件 下的缓冲体系中， 4℃条件 下， 将带有 标签的所述重组硫醇活化细胞溶血素 蛋白与TEV剪切酶摩尔比为1:5 0或1:100的比例混合， 反应16 h。 3.一种表达载体， 连接有SEQ  ID NO.1或2所示的核苷酸序列 作为目的片段。 4.如权利要求3所述的表达载体， 以空载体的多克隆位点连接所述目的片段， 所述空载 体选自pGEX6P1、 pGEX6P2、 pGEX ‑4T‑AB1、 pGEX4T2、 pMAL ‑c2x、 pMAL ‑c5x、 pPICZα A或pGAPZα A。 5.权利要求3或4所述的表达载体的构建方法， 其包括以下步骤： 获得目的片段， 所述目的片段为SEQ  ID NO.1或2所示的核苷酸序列； PCR扩增目的片段， 并与线性化的空载体质粒于金属浴50℃进行同源重组反应30min， 即可得到所述表达载体。 6.根据权利要求5所述的构建方法， 其中， 扩增目的片段的PCR反应体系包括： 上/下游 引物各1 μL、 Gl oria Nova HS 2X HF Master Mix 25 μL、 ddH2O 22 μL和模板1 μL； 扩增目的片段的PCR反应程序包括： 98℃/5min →98℃/20s →60/30s→72℃/2kb/1min →72℃/10min →16℃/1h， 其中， 98 ℃/20s→60℃/30s→72℃/2kb/1mi n的步骤设置 30个循环。 7.根据权利要求5所述的构建方法， 其中， 同源重组反应体系包括： 目的片段2μL、 线性 化的空载体质粒3 μL和2 ×M μltiF SeamLess Assembly Mix 5 μL。 8.根据权利要求7所述的构建方法， 其中， 目的片段与线性化的空载体质粒反应摩尔比 为3:1～10:1。 9.引物组， 用于扩增重组硫醇活化细胞溶血素蛋白的编码的目的片段， 所述目的片段 为SEQ ID NO.1或2所示的核苷酸序列； 包括如SEQ  ID NO.5～8所述的核苷酸序列。 10.一种包 含权利要求2所述的表达载体的宿主细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854771 A 2硫醇活化细胞溶 血素蛋白的重组表达 技术领域 [0001]本申请涉及硫醇活化细胞溶血素蛋白的技术领域， 尤其涉及硫醇活化细胞溶血素 蛋白的重组表达， 具体涉及硫醇活化细胞溶血素蛋白的表达载体、 构建方法、 引物组、 宿主 细胞和制备 方法。 背景技术 [0002]硫醇激活的细胞溶血素(TACY s， Thiol‑activated cytolysin)家族是一组重要的 细菌毒素， 其中链球菌溶血素O(SLO)是其原型。 这一组的成员由20多种革兰氏阳性细菌， 并 与化脓性隐球菌、 产气荚膜梭菌、 单核细胞增 生李斯特菌和肺炎链球菌等物种的感染发病 机制密切相关。 这些毒素有许多共同特征， 可将其归类为一组。 它们合成为水溶性单链多 肽， 分子量为47～60kDa， 通过在细胞膜上形成孔对真核细胞具有溶解作用。 该组织因其细 胞溶解活性对氧的敏感性以及通过还原 化合物(硫醇活化)的活化而得名。 胆固醇是这些毒 素的主要靶细胞受体， 少量游离胆固醇可抑制溶解活性。 该组成员 在一级氨基酸序列上显 示出30～60％的相 似性， 并且包含几乎所有的氨基酸序列位于蛋白质C末端附近的不变11 肽序列(ECTGLAWEWWR)。 TACYs与许多革兰氏阳性病原 体感染的发病机制有关。 然而， 只有少 数革兰氏阳性病原体进行了首次基因敲除实验， 以证明TAC Ys在感染中的作用。 [0003]因此在体外进行重组表达TACYs具有重要意义， 有研究利用大肠杆菌表达系统重 组表达带His标签的TACYs重组蛋白为包涵体形式， 不仅纯度较低， 同时带有标签的TACYs蛋 白往往限制了该蛋白本身的功能， 而传统切除标签蛋白的方法需要将融合蛋白从层析柱上 洗脱下来， 再进行切除标签， 就会导致样品中的杂质成分过多， 增加了后续的纯化步骤及难 度。 因此， 急需一种快速制备 无标签、 纯度高、 有产业 化前景的TACYs的方法。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本申请提供一种表达载体、 宿主菌及快速制备无标签、 纯度高的重组硫 醇激活的细胞 溶血素的方法， 以至少解决上述 技术问题之一。 [0005]第一方面， 本申请实施例公开了一种硫醇活化细胞溶血素蛋白的重组表达方法， 包括： [0006]获得编码所述重组硫醇活化细胞溶血素蛋白的目的片段， 所述目的片段为SEQ  ID  NO.1或2所示的核苷酸序列； [0007]构建连接有所述目的片段的表达载体； [0008]将所述表达载体转 化至宿主细胞中， 获得表达细胞； [0009]活化和培 养所述表达细胞， 收集培 养液， 并对所述培 养液进行提取和纯化； [0010]对纯化得到的带有标签的所述重组硫醇活化细胞溶血素蛋白进行酶切， 以得到无 标签的所述重组硫醇活化细胞 溶血素蛋白。 [0011]在本申请实施例中， 所述酶切步骤具体包括： 于50mM  Tris， 100mM  NaCl条件下的 缓冲体系中， 4℃条件下， 将带有标签的所述重组硫醇活化细胞溶血素蛋白与TEV剪切酶摩说　明　书 1/8 页 3 CN 114854771 A 3