(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210532475.X (22)申请日 2022.05.12 (71)申请人 中国农业大 学 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 (72)发明人 韩红兵　位韶　艾越　 (74)专利代理 机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 专利代理师 董函竹 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C40B 50/06(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/18(2006.01)C12Q 1/02(2006.01) G01N 15/14(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61K 39/112(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 特异性识别鼠伤寒 沙门氏菌的T细胞亚群及 其应用 (57)摘要 本发明公开了特异性识别鼠伤寒沙门 氏菌 的T细胞亚群及其应用。 具体地公开了特异性识 别鼠伤寒沙门氏菌的CD4+TCRVβ6+T细胞亚群在 制备用于治疗沙门氏菌病、 筛选治疗沙门氏菌病 的候选药物、 制备用于增强机体抵抗和清除沙门 氏菌感染的药物以及在抗鼠伤寒沙门氏菌的疫 苗研究中的应用。 本发明还提供了一种构建沙门 氏菌病TCRβ链基因测序文库的方法。 本发明首 次发现了CD4+TCRVβ6+T细胞亚群具有特异性识 别鼠伤寒沙门氏菌的功能， 用鼠伤寒沙门氏菌感 染小鼠后， CD4+TCRVβ6+T细胞亚群的频率显著 升高， 经实验表明CD4+TCRVβ6+T细胞亚群在抵 抗和清除沙门氏菌感 染的过程中具有重要作用。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图7页 CN 114854686 A 2022.08.05 CN 114854686 A 1.CD4+TCRVβ 6+T细胞亚群的下述任一种应用： A1)在制备用于治疗沙门氏菌病的药物中的应用； A2)在筛选治疗沙门氏菌病的候选药物中的应用； A3)在制备用于增强机体抵抗和清除沙门氏菌感染的药物中的应用； A4)在抗鼠伤寒沙门氏菌的疫苗研究中的应用； A5)在制备识别鼠伤寒沙门氏菌的试剂中的应用； 所述CD4+TCRVβ 6+T细胞亚群为表达TCRVβ 6和CD4的T细胞。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述沙门氏菌病是由鼠伤寒沙门氏菌引起 的疾病。 3.权利要求1中所述的CD4+TCRVβ 6+T细胞亚群作为生物标志物在制备用于诊断或辅助 诊断沙门氏菌感染的试剂或试剂盒中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述诊断或辅助诊断沙门氏菌感染是通过 检测所述CD4+TCRVβ 6+T细胞亚群的数量比例实现。 5.权利要求1中所述的CD4+TCRVβ 6+T细胞亚群。 6.一种构建TCRβ 链基因测序文库的方法， 其特 征在于， 所述方法包括如下步骤： B1)提取沙门氏菌感染的样本中的总RNA； B2)将所述总RNA反转录成带有通用接 头的cDNA； B3)以所述cDNA为模板， 以SEQ  ID No.1所示的上游引物F和SEQ  ID No.2所示的下游引 物R进行第一轮PCR扩增， 第一轮扩增产物稀释后作为模板， 进行第二轮PCR扩增， 得到第二 轮PCR产物， 纯化后得到所述TCRβ 链基因测序文库。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述沙门氏菌感染的样本为人或动物的血 液样本、 脾脏样本或淋巴结样本 。 8.用于构建沙门氏菌病TCRβ链基因测序文库的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 权利要求6中所述的上游引物F和下游引物R。 9.权利要求8所述的试剂盒在构建沙门氏菌病TCRβ 链基因测序文库中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854686 A 2特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的T细胞亚群及其应用 技术领域 [0001]本发明属于细胞免疫领域， 具体涉及特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的CD4+TCRVβ 6+T 细胞亚群及其应用。 背景技术 [0002]鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella  typhimurium)是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏 菌， 宿主比较广泛， 能引起各种家禽和哺乳动物的传染病， 也可引起人类感染， 具有重要的 公共卫生意义。 鼠伤寒沙门氏菌是人和动物肠道主要病原菌之一， 可引起人类的肠胃炎， 是 由饮用或食用污染的水或食物引起的， 主要症状为急性结肠炎， 伴随着炎症性腹泻。 除此之 外， 鼠伤寒沙门氏菌还可引发牛肠炎和小鼠的系统性疾病。 沙门氏菌病不仅对畜牧业生产 造成巨大经济损失， 而且也严重威胁人类健康。 目前抗菌药物的使用是治疗沙门氏菌感染 的重要措施， 但由于滥用、 乱用抗菌药物导致了细菌的严重耐药， 一些沙门氏菌携带具耐药 因子的遗传质粒， 耐药因子可传递对多种抗生素的耐药性， 尤其可在敏感细菌中散播， 给沙 门氏菌感染的治疗造成困难。 因此， 寻找新型 药物及治疗方案已成为当前的研究重点。 [0003]沙门氏菌感染后最终被病原菌特异性的B细胞和T细胞 免疫反应控制和清除， 这些 免疫反应也可保护机体免受二次感染。 T细胞受体(T  cell receptor， TCR)特异性识别组织 相容性‑多肽复合物(peptide  histocompatibility， pMHC)的过程是T细胞激活的第一信 号。 TCR在 T细胞表面表达， 是由两条链组成的异二聚体， 具有多样性。 大多数T细胞由α和β 链 组成， 少数由γ和 δ组成。 α β TCR中的β 链由可变区(variable， V)、 多变区(diversity， D)、 结 合区(joining， J)和恒定区(constant， C)四个区域组成， 而α 链由V、 J和C三个区域组成。 V ‑J 之间的连接区即互补决定区3(Complementarity ‑determining  region 3， CDR3)具有高度 变异性， 是识别不同MHC ‑抗原肽的主要区域。 在小鼠中V、 D和J区均包括多种基因， 而C区只 有一种基因类型。 TCR的多样性依赖于组合和连接处的多样性。 组合的多样性是指α和β 链都 由不同的V(D)J基因片段随机组合形成； 连接处的多样性是由V ‑D和D‑J( β 链)或V ‑J( α 链)连 接处碱基无模板的随机删减和插入形成的， α链和β 链的随机组合进一步增加了TCR的多样 性。 单个人体TCRβ链本身的多样性及β链与α链组合的多样性， 能形成至少1011以上种类的 TCR， 不同T细胞克隆具有不同序列或不同长度的TCR  CDR3基因， 从而决定了其特异性， 进而 反映了T细胞的功能状态。 由于CDR3是与抗原直接接触的TCR区域， 因此CDR3在TCR与肽 ‑MHC 复合物的相互作用中起到 了十分重要的作用。 [0004]常用的分析TCR基因中CDR3序列的方法是PCR ‑谱型分析 ‑序列分析法。 即根据TC RV 基因不同家族及恒定区的序列分别设计上下游引物， 其中下游引物带入FAM荧光标记。 PCR 扩增后的产物在序列分析仪上进行变性凝胶电泳， 通过Genscan软件分析不同碱基位置的 荧光强度并转化为峰图。 根据峰形的变化、 峰 的个数及高度判断CDR3的克隆性增生， 再通过 克隆、 转化结合Sanger测序分析CDR3的序列。 但 这种方法存在准确性和敏感性低等弊端。 近 几年， 高通量测序技术快速发展并能进行大规模的序列分析且灵敏度高， 因此被广泛用于 免疫组库的分析中。 TCR序列的扩增的方法主要包括两种： 多重PCR扩增和5'RACE扩增。 多重说　明　书 1/7 页 3 CN 114854686 A 3