(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210524790.8 (22)申请日 2022.05.13 (71)申请人 大连理工大 学 地址 116024 辽宁省大连市高新园区凌工 路2号 (72)发明人 刘猛　石蒙　迟艳琛　刘月　 (74)专利代理 机构 大连东方专利代理有限责任 公司 21212 专利代理师 周媛媛　李馨 (51)Int.Cl. C12M 1/00(2006.01) C12M 1/36(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/42(2006.01) C12M 1/04(2006.01)C12M 1/24(2006.01) C12M 1/38(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称 一种基于脱氧核酶的细菌高通量定量检测 系统与应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于脱氧核酶的细菌高 通量定量检测系统与应用， 属于生物检测技术领 域。 该系统包括： 电源模块、 供压模块、 微流控液 滴生成模块、 荧光检测模块和光电转换模块。 微 流控液滴生成模块将包含细菌的水相与油相共 混， 实现单细菌包裹， 在细菌包裹后， 在液滴生成 模块中进行短时的孵育， 完成目标物识别； 存在 细菌的液滴会产生强烈的荧光信号， 被荧光检测 器检测， 经光电转换装置传输至电脑， 进行细菌 计数。 本系统采用微液滴反应模式， 将每个步骤 高度集成化， 减小人为操作和实验误差， 更重要 的是提高检测速度和通量， 弥补了传统培养方法 的弊端； 并结合新型的分子生物学方法提高了定 性和定量的准确性； 装置结构简单， 易于在实验 室推广使用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 115109679 A 2022.09.27 CN 115109679 A 1.一种基于脱氧核酶的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 包括顺次连接的供压 模块、 滴液生产模块、 检测模块和光电转换模块； 所述供压模块包括顺次连接的气 体供应装 置(1)、 压力泵(2)、 样 品瓶组， 所述样 品瓶组与液滴生成模块连接， 所述样品组包括并联在 压力泵(2)和液滴生 成模块之间的油相样品瓶(3)和水相样品瓶(4)； 所述水相样品瓶(4)和 滴液生产模块之间设有流量传感器a(6)， 所述油 样样品瓶(3)和滴液生产模块之前设有流 量传感器b(5)； 所述液滴生成模块包括微流控芯片(11)， 所述微流控芯片(11)包括水样入 口(12)、 油样入口(13)、 出口(14)以及连接入口和出口的流道， 连接水样入口的流道与连接 油样入口的通道在达到出口(14)前交汇， 所述水相样品瓶(4)与水样入口(12)连接， 所述油 样样品瓶(3)与油样入口(13)连接， 所述出口(14)与毛细管(15)的一端 连接， 毛细管(15)的 另一端与检测模块(17)连接 。 2.根据权利要求1所述的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述气体供应装置 (1)包括氮气瓶或空气压缩机； 所述气体供应装置(1)的气体流速是10～10 0nL/min。 3.根据权利要求1所述的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述毛细管(15)的内 径为25～100 μm， 长度为10～200cm； 所述毛细管(15)内的液滴为水包油或油包水， 每个液滴 内包含一个细菌 。 4.根据权利要求1所述的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述微流控芯片(11) 上设有水样入口(12)、 油样入口(13)、 出口(14)以及连接水样入口(12)和出口(14)的水样 流道(20)、 连接油样入口(13)和出口(14)的油样流道(19)， 所述水样入口(12)、 油样入口 (13)和出口(14)在同一条直线上； 所述油样流道(19)由靠近油样入口(13)处分支成两条平 行的流道， 并在出口(14)前与水样流道(20)交汇， 共同连接至出口(14)； 或者所述水样流道 (20)由靠近水样入口(12)处分支成两条平行的流道， 并在出口(14)前与油样流道(19)交 汇， 共同连接 至出口(14)。 5.根据权利要求1所述的细菌 高通量定量检测系统， 其特征在于： 滴液生产模块包括温 控系统(16)， 所述温控系统(16)控制微 流控芯片(1 1)和毛细管(15)的温度。 6.根据权利要求1所述的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述检测模块(17)包 括荧光检测器， 所述荧光检测器的光源照射至毛细管 的透明光窗上， 用于激发荧光标记的 目标蛋白； 所述光电转换模块(18)包括信号采集器和数据处理器， 荧光信号被荧光检测器接收， 然后通过信号采集器传输 至数据处 理器， 定量计数细菌数目。 7.根据权利要求1所述的细菌 高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述细菌包括肺炎克 雷伯菌、 大肠杆菌 。 8.根据权利要求1所述的细菌高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述水相样品瓶(4) 中包括细菌样品、 缓冲溶液、 脱 氧核酶溶液； 所述细菌样品包括尿液、 痰液或者粪便； 所述油 相样品瓶(3)中包括3 MTMNovecTM7500的氟化油。 9.根据权利要求1所述的细菌 高通量定量检测系统， 其特征在于： 所述脱氧核酶溶液包 括如SEQ ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的脱氧核苷酸链。 10.权利要求1 ‑9中任一项所述的系统在高通 量定量检测细菌中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115109679 A 2一种基于脱氧核酶的细菌高通量定量 检测系统与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 更具体地说， 涉及一种基于脱氧核酶的细菌高通 量定量检测系统与应用。 背景技术 [0002]公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解， 而不必然 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技 术。 [0003]目前， 致病型细菌已成为公众健康的重大威胁， 针对细菌 的高通量检测是实现致 病菌有效控制的关键。 目前， 临床上已发现多种严重威胁人类健康和生态系统的致病菌。 因 此， 发展对于致病菌的快速、 高通量检测技术， 对实现污染控制、 进一步防止抗生素滥用、 阻 止多药耐药菌的形成以及临床治疗指导 等方面具有重大意 义。 [0004]当前细菌检测方法主要包括培养法和基因检测法。 其中， 培养法是金标法， 但受灵 敏度限制， 该方法需对采集样本长时间培养， 获得相对大量存活的细菌来满足定性和定量 分析的准确性， 具有周期 长(1～2天)、 样品前 处理步骤繁琐等固有缺陷， 已经难以满足当前 临床的需求。 近年来， 发展了多种基于基因检测的新兴分子生物学技术， 例如定量PCR   (FilmArray  BCID)、 合成生物学(CRISPR)、 测序法(Oxford  Nanopore MinION)以及一些新 兴的生物传感法。 许多细菌鉴定方法可将检测时间缩短至数小时且检测 通量较高， 但对于 低浓度细菌(1～100CFU/ mL)仍需长时间培养富集、 检测通量有限。 此外， 这些方法通常需要 昂贵的设备和复杂的样品前处理(如细胞裂解、 核酸提取)来纯化和富集 目标， 而且纯化时 还可能导致 目标物丢失， 进一步降低检测灵敏度。 因此， 建立具有高灵敏、 高通量的细菌分 析方法是解决细菌快速分析问题的关键， 创建对应的分析系统也是实现检测的基础。 [0005]脱氧核酶是指通过体外筛选即指数富集的配体系统进化技术  (Systematic   Evolution of Ligands by Exponential  Enrichment,SELEX)获得的具有特殊结构和功能 的核酸分子片段， 主要包括具有特异性识别靶标物质的适配体、 具有催化能力的脱氧核酶 和同时具有靶标物质识别和催化功能的适配体核酶等。 其中， 脱氧核酶的生物学识别功 能 与抗体极为相似， 且具有靶标范围广、 稳定性高、 便于化学修饰和合成等诸多优点。 将脱氧 核酶与荧光分子键合后， 可以形成分子信标， 用于检测目标物。 因此， 其为识别分子用于生 物传感得到快速发展， 广泛应用于核酸、 蛋白质、 生物活性分子、 疾病标志物的识别与检测， 并表现出良好的应用前 景。 [0006]目前， 针对致病菌的高通量、 快速检测方法多为基因分析法， 只能完成基因型分 析， 并不能实现表型分析， 为获得更详细的耐药信息， 开发新型、 高通量的致病菌表型分析 方法和检测系统具有重要意 义。 发明内容 [0007]为解决现有技术存在的问题， 本发明提供了一种基于脱氧核酶的细菌高通量定量说　明　书 1/5 页 3 CN 115109679 A 3