(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210525187.1 (22)申请日 2022.05.15 (71)申请人 赣南师范大学 地址 341000 江西省赣州市 蓉江新区 (72)发明人 苏华楠　李利娜　王凯丽　钟八莲　 黄爱军　 (74)专利代理 机构 北京科家知识产权代理事务 所(普通合伙) 11427 专利代理师 戴明虎 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 柑橘黄龙病菌内参基因metG筛 选和应用 (57)摘要 本发明公开了柑橘黄龙病菌内参基因metG 的筛选和应用， 根据感染黄龙病的柑橘木虱和柚 子转录组测序分析结果， 对rpoC、 Con1、 Con2、 clpX、 ubiG、 rplU、 rpsA、 metG、 omp31、 ftnA、 carD、 groL、 B2I23_RS01640、 ffh、 omp/bamA等15个初步 筛选出的变异系数较小的CLas候选内参基因， 进 行引物特异性筛选、 相对表达量 分析及表达稳定 性评价与验证， 最终确定特异性强且在不同寄主 中稳定表 达的内参基因metG， 可应用于CLas在柑 橘木虱和柑橘寄主中的基因表达研究。 本发明的 内参基因在CLas昆虫寄主和植物寄主中均能稳 定表达， 提高了黄龙病菌基因表达研究时的可靠 性和稳定性， 可广泛用于评估黄龙病菌基因在不 同寄主中表达量分析， 且筛选出的9对特异性内 参引物也可用于柑橘黄 龙病的qPCR检测鉴定， 具 有重要的应用价 值。 权利要求书1页 说明书14页 序列表5页 附图5页 CN 114958875 A 2022.08.30 CN 114958875 A 1.柑橘黄龙病菌内参基因metG， 其特 征在于， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG在研究黄龙病菌在昆虫寄主柑橘木 虱和植物寄主柑橘中的基因表达分析中的应用。 3.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选， 其特征在于， 方法步骤如 下： S1： 通过多样本转录组数据分析， 筛选表达量相对较高的基因， 并筛选变异系数较小的 基因作为 候选基因； S2： 进行引物特异性筛 选， 去除特异性 不佳的候选基因； S3： 根据不同黄龙病菌内参候选基因RT ‑qPCR结果得到的C q或Ct值， 依次采用不同单一 内参对所有候选内参基因进行数据归一化， 然后使用在线工具RefFinder并结合geNorm、 Normfinder、 BestKeeper和Delta  CT四种分析方法， 综合分析黄龙病感病柑橘木虱和柚子 中病原菌候选内参基因的稳定性； S4： 结合候选基因相对表达量、 表达稳定性评价， 以及进行最佳内参验证， 最终筛选获 得最优内参基因。 4.根据权利要求3所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选， 其特征在于， 内参基因 的 相对表达量采用2‑ΔCq法计算。 5.根据权利要求3所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG的筛选， 其特征在于， 所述内参基 因metG的引物如SEQ  ID NO.4‑5所示。 6.如权利要求1所述的柑橘黄龙病菌内参基因metG在黄龙病qPCR或RT ‑qPCR检测试剂 盒中的应用。 7.如权利要求3所述的内参基因metG的引 物在制备黄龙病qPCR或RT ‑qPCR检测试剂盒 中的应用。 8.一种黄龙病qPCR或RT ‑qPCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括核苷酸序列如SEQ  ID  NO.1所示的内参基因metG、 如SEQ  ID NO.4‑5所示的对应引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958875 A 2柑橘黄龙病菌 内参基因metG筛选和应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子植物病理学技术领域， 尤其涉及柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选 和应用。 背景技术 [0002]柑橘黄龙病(Citrus  Huanglongbing,HLB)是一种由革兰氏阴性细菌 ‑韧皮部杆菌 ('Candidatus  Liberibacter')侵染引起的检疫性病害， 该病原菌可在柑橘和传病媒介昆 虫柑橘木虱(Diaphorina  citri Kuwayama)体内繁殖， 且在木虱体内增殖更快。 基于病原菌 的热敏感性、 分布区域、 传播媒介的种类和16SrDNA序列信息， 将柑橘黄龙病菌分为韧皮部 杆菌亚洲种('Candidatus  Liberibacter  asiaticus',CLas)、 非洲种('Candidatus   Liberibacter  africanum',CLaf)和美洲种('Candidatus  Liberibacter  americanum', CLam)。 目前公认的我国主要为韧皮部杆菌亚洲种。 HLB 主要通过带病苗木和柑橘木虱传播， 几乎可侵染所有的柑橘类植物， 对世界柑橘产业造成破坏性的影响， 其破坏力已远远超过 其它任何柑橘病害， 最近的研究结果显示柑橘黄龙病是一种韧皮部杆菌触发的免疫性疾 病。 [0003]反转录实 时荧光定量PC R(RT‑qPCR)是基因表达研究常用的方法， 具有极 高的检测 灵敏性和特异性。 有研究通过RT ‑qPCR对黄龙病菌效应子基因在柑橘寄主中和 木虱寄主中 的表达量进行分析， 结果表明不同寄主中存在显著差异。 如CLIBASIA_00460效应子基因仅 在柑橘中大量表达， 而CaLasSDE115效应子基因在木虱中表达量显著高于柑橘等。 这些差异 表达的基因预示着在不同的寄主中分别有着不同的重要功 能。 在基因表达量分析中， 内参 基因选择的优劣直接影响结果的准确性。 而 特异性强且稳定表达的内参基因可有效通过标 准化/归一化校正RNA提取和cDNA合成过程中带来的偏差， 进而确保RT ‑qPCR实验结果的准 确性， 使不同样本之间目的基因的比较成为可能。 而且不同黄龙病感病柑橘样品和木虱样 品中CLas的病菌含量也不相同， 寄主植物/昆虫的内参基因不能矫正由于病菌含量不同产 生的偏差， 必须经合适的黄龙病菌内参基因先进 行归一化， 才 可进行样本间的比较， 否则将 会得到完全错误的基因表达信息。 理想的病原菌内参基因应该在各种实验条件下、 在不同 寄主中、 在不同组织和细胞中均能稳定表达， 然而， 近些年来文 献报道中关于黄龙病菌的内 参基因大多都有不足之处， 很多都不适用于跨寄主分析， 只适合在寄主植物中使用或者寄 主昆虫中使用。 此外， 在黄龙病菌体内大部 分基因都并非高表达， 若使用黄龙病常用的多拷 贝超高表达的16SrDNA、 rplJ或线粒体细胞色素氧化 酶COX基因作为内参校准黄龙病菌体内 低表达基因将会引入较大的误差。 故在CLas的RT ‑qPCR基因表达研究中， 选择与预期Cq或Ct 值更接近目标基因的内参基因是首选。 此外， 常用于分子或血清学检测靶标的omp/bamA基 因也常作为内参， 但未见对其在不同寄主中的表达稳定性进行评估。 因此筛选CLas在植物 和昆虫两类寄主中都稳定表达的且非超高表达的内参基因就显得 尤为重要。说　明　书 1/14 页 3 CN 114958875 A 3