(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210539574.0 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 浙江省中 医院、 浙江中 医药大学附 属第一医院 （浙江省东方医院） 地址 310000 浙江省杭州市上城区邮电路 54号 (72)发明人 梁利国　李阳　王嘉龙　陆思铭　 姚航平　黄宣　陈喆　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 邱启旺 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12R 1/385(2006.01) (54)发明名称 一种铜绿假单胞菌多酶恒温扩增检测试剂 盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种铜绿假单胞菌多酶恒温 扩增检测试剂盒， 所述试剂盒包括用于检测 铜绿 假单胞菌的引物探针组； 所述引物探针组中的引 物包括上游引物、 下游引物和探针引物， 其中， 上 游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 下游 引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示； 探针引 物的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示。 本发明能 够特异性的对铜绿假单胞菌进行检测， 作为一种 简便快速的初筛方法， 能够成功 检出样品中的铜 绿假单胞菌， 相对于现有的荧光定量PCR检测法 具有准确率高、 检测速度快的优势， 临床实用价 值大。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图1页 CN 114717344 A 2022.07.08 CN 114717344 A 1.一种铜绿假单胞菌多酶恒温扩增检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括用于检 测铜绿假单胞菌的引物探针组； 所述引物探针组中的引物包括上游引物、 下游引物和探针 引物， 其中， 上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示， 下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所示； 探针引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示。 2.一种权利要求1所述的试剂盒在检测铜绿假单 胞菌方面的用途。 3.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于， 具体为： 提供待测样品的DNA， 随后利用铜 绿假单胞菌多酶恒温扩增检测试剂盒进行多酶恒温扩增。 4.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述待测样品包括细菌核酸模板、 细菌单 克隆培养菌落、 细菌 培养液、 含有铜绿假单 胞菌的水源和肠道分泌物中的至少一种。 5.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述多酶恒温扩增的反应体系中， 引物的 初始浓度均为2 ～20mmol/L， 醋酸镁的初始浓度为5 0‑280mmol/L。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717344 A 2一种铜绿假单胞菌多酶恒 温扩增检测试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 生物医学检测技术领域， 尤其是涉及 一种铜绿假单胞菌多酶恒温扩增 检测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]铜绿假单胞菌(Pseudomonas  aeruginosa， PA)， 又名绿脓杆菌， 是一种环境中普遍 存在的人类病原体， 该生物体是发病率和死亡率上升的最重要的临床和流行病学原因之 一。 铜绿假单胞菌在引起院内感染最主要的革兰氏阴性菌中位居第四， 仅次于鲍曼不动杆 菌、 肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌， 给 临床治疗 带来了巨大的挑战。 这种感染可导致肺功 能慢性下降以及致死率增加； 铜 绿假单胞菌也可以在严重烧伤、 气管插管或机械通气患者 等上皮障碍或受损的人群中引起急性感染。 [0003]目前对铜绿假单胞菌的检测方法有多种， 传统鉴定铜绿假单胞菌的方法是根据 《全国临床检验操作规程》 ， 常规分离培养细菌、 镜下观察、 生化指标鉴定等， 是铜 绿假单胞 菌检测的“金标准”， 这些检测手段不仅需要专业技术人员和复杂的设备仪器， 同时鉴定过 程耗时长  (48h)， 操作复杂， 灵敏性低。 临床上迫切需要研制一种可以快速有效检测铜绿假 单胞菌的方法。 [0004]酶联免疫 吸附(ELISA)技术和电化学技术也被用于铜绿假单胞菌的快速检测。 但 是， 上述方法操作相对复杂， 比较费时， 且精确性较差。 现阶段聚合 酶链式反应(PCR)方法和 环介导等 温扩增(LAMP)方法也被用于铜绿假单胞菌的快速检测。 但是， PCR技术需要昂贵的 PCR 仪、 配套完善的实验室条件和专 业的操作人员， 从而限制了铜绿假单胞菌PCR方法在基 层实验室和现场的应用。 作为等温核酸扩增技术， LAMP方法在操作方便性和设备需求方面 具有更加明显优势， 但是 该种方法 反应时间在6 0min左右。 [0005]多重酶恒温扩增(Mult i‑Enzyme Isothermal  Amplificat ion,MIA)其原理为重组 酶与引物结合形成的蛋白 ‑DNA复合物， 能在双链DNA中寻找同源序列。 一旦引物定位了同源 序列， 就会发生链交换反应形成并启动DNA合成， 对模板上的目标区域进行指数式扩增。 被 替换的 DNA链与SSB结合， 防止进一步替换。 在这个体系中， 由两个相对的引物起始一个合 成事件。 整个过程进行 得非常快， 一般可在10分钟之内获得 可检出水平的扩增产物。 [0006]因此， 研究开发出一种基于恒温扩增的MIA检测方法， 该方法具有准确率高、 检测 速度快， 能够特异 性的对铜绿假单胞菌进 行检测的一种铜绿假单胞菌多酶恒温扩增检测试 剂盒， 变得十分必要和迫切。 [0007]有鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0008]本发明的目的在于针对现有技术的不足， 提供一种铜绿假单胞菌多酶恒温扩增检 测试剂盒及其应用， 本发明具有检测准确率高、 检测速度快的优势， 能够特异 性地对铜绿假 单胞菌进行检测。说　明　书 1/8 页 3 CN 114717344 A 3