(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210533264.8 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 中国科学院昆明植物研究所 地址 650201 云南省昆明市盘龙区蓝黑路 132号 (72)发明人 贺正山　杨俊波　张志荣　杨继雄　 杨静　贾艳霞　曾春霞　 (74)专利代理 机构 昆明祥和知识产权代理有限 公司 53114 专利代理师 马晓青 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01)C12N 15/11(2006.01) G16B 20/30(2019.01) G16B 50/00(2019.01) (54)发明名称 一种基于ITS序列和matK序列鉴定睡莲杂种 的两个亲本的方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于ITS序列和 matK序列 鉴定睡莲杂种的两个亲本的方法， 属于植物分子 鉴定技术领域， 本发明的方法是基于一代测序得 到睡莲杂种的双亲遗传的核基因组片段ITS序列 和母系遗传的叶绿体基因组片段 matK序列， 将 GenBank下载的ITS和 matK序列， 经过严格的筛选 后分别建立睡莲属的ITS和 matK序列数据库， 通 过将待测定 亲本睡莲的ITS和 matK序列分别 与对 应的数据库比对， 基于遗传距离构建邻接树， 并 通过检查特异位点， 从而 得到待测定睡莲的父本 和母本的信息。 结果表明， 基于GenBank下载并构 建的睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库， 通过 测序待鉴定亲本的睡莲杂种的ITS序列和 matK序 列， 能够通过遗传距离 法鉴定得到睡莲杂种的母 本和父本信息 。 权利要求书4页 说明书10页 序列表8页 附图2页 CN 114766348 A 2022.07.22 CN 114766348 A 1.一种基于ITS序列和 matK序列鉴定睡莲杂种的两个亲本的方法， 该方法包括下述步 骤： 构建睡莲属ITS和 matK核酸序列数据库， 然后设计睡莲属适用引物进行PCR扩增， 最后将 单克隆测序的ITS和 matK序列与已建立的对应的序列数据库比对， 依据遗传距离构建邻接 树并检查特异位 点， 得到睡莲杂种父本和母本的物种信息 。 2.一种基于ITS序列和 matK序列鉴定睡莲杂种的两个亲本的方法， 该方法包括下述步 骤： 构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库： 下载已有的睡莲属ITS和 matK核苷酸序列； 采取严格的过滤步骤， 对ITS和 matK序列每个“种单元”物种/亚种/变种/变型/杂交种保留 一条序列； 最后， 比对后调整序列方向不一致的序列， 然后重新比对后分别得到睡莲属ITS 和matK核酸序列的数据库； 整理最终得到的序列的序列名， 格式为 “物种名/序列的 ACCESSION”； 制备睡莲属待测定亲本的物种的ITS单克隆序列和设计引物测序的 matK核苷酸序列： 提取待测定亲本的睡莲的基因组DNA； 设计引物； PCR序列扩增； 一代测序； 序列比对、 构建邻 接树， 最后将单克隆测序的ITS和 matK序列与已建立的对应的序列数据库比对， 依据遗传距 离构建邻接树并检查特异位 点， 得到睡莲杂种父本和母本的物种信息 。 3.根据权利要求1或2所述的基于ITS序列和 matK序列鉴定睡莲杂种 的两个亲本的方 法， 其特征在于， 其中构建睡莲属ITS和 matK核酸序列数据库的步骤如下： a. 以“((Nymphaea[Organism])  AND 5.8S[Title])  NOT PREDICTED[Title] ”和 “((Nymphaea[Organi sm]) AND matK[Title]) NOT PREDICTED[ Title]”语法搜索美国国家 生物技术信 息中心 （NCBI） 核酸数据库 （www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide） ， 得到睡莲属 全部的ITS和 matK序列数据； 同时以 “(chloroplast,  complete  genome[Title]  OR  plastid,  complete  genome[Title])  AND Nymphaea[Organism] ”语法得到59个已发表的 睡莲属叶绿体 基因组， 并提取其中的 matK序列； b. 采取严格的过滤步骤， 对ITS和 matK序列每个“种单元”即物种/亚种/变种/变型/杂 交种保留一条序列； c. 比对后调整序列方向不一致的序列， 然后 重新比对后分别得到睡莲属ITS和 matK核 酸序列的数据库。 4.根据权利 要求2所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述的过 滤步骤为： a. 去掉物种名含unverified、 sp.和cf.的， 保留种下等级亚种、 变种、 变型和明确的杂 交种， 简称其为 “种单元”， 将isolate、 voucher、 genotype、 strain等都视为栽培种， 将归在 每个“种单元”内部； b. 若“种单元”仅含一条序列， 则不过 滤； 过滤后每个“种单元”最终仅保留一条序列； c. 若步骤a中的栽培种 的序列与“种单元”的序列差异较大， 则优先去掉栽培种的序 列； d. 优先去掉差异明显过大， 特别是编码区如5.8S  rRNA的序列， 优先去掉含未知碱基、 简并碱基的序列， 优先保留更长的序列； e. 叶绿体基因组中提取得到 matK序列仅作为补充使用， 当测序得到的 matK序列已有 “种单元”， 则优先舍弃从叶绿体 基因组中提取 得到的matK序列；权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 114766348 A 2f. 最终保留的序列为最能代表该 “种单元”的序列， 即与多条序列得到的一致性序列 最接近的序列。 5.根据权利 要求2所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述的制备睡莲属待测定亲本的物种的ITS序列和设计引物测序的 matK序列步骤为： a. 采用睡莲属18S、 5.8S和25S  rRNA的保守核苷酸序列参考植物条形码ITS通用引物 设计睡莲属适用的ITS引物， 采用睡莲属 matK的保守核苷酸序列参考植物通用条形码引物 设计睡莲属适用的 matK引物； b. 提取待测定亲本的睡莲的基因 组DNA； c. 以步骤b提取的待测定亲本的睡莲的基因组DNA为模版， 利用步骤a设计的引物进行 PCR扩增， 分别得到ITS和 matK序列的扩增产物； d. 以步骤c得到 的ITS序列的扩增产物， 使用pLB零背景快速克隆试剂盒连接， 并转化 到DH5α 感受态细胞， 然后将挑取的菌斑经载体引物PCR扩增得到ITS序列克隆扩增的PCR扩 增产物； e. 将步骤c得到 的matK序列的扩增产物和步骤d得到的ITS序列克隆扩增产物经一代 测序仪测序， 将测序结果进行序列拼接， 得到待测定亲本的睡莲的 matK序列和单克隆的ITS 序列。 6.根据权利 要求5所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述的引物为： ITS‑5， 其核苷酸序列为AGTCGTA ACAAGGTTTCCGT； ITS‑3， 其核苷酸序列为TAGTA ACGGCGAGCGA ACC； matK‑5， 其核苷酸序列为CGTAC CGTACTTTTATGTTTACGAG； matK‑3， 其核苷酸序列为AC CCAATCCATCTGGAAATCTTGCTTC。 7.根据权利 要求5所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述PCR扩增的反应 体系为： ITS序列的PCR的扩增体系为30 μL， 体系包含PCR  2× Mix 15 μL， ddH2O 13 μL， 引物各0.5 μL， 总DNA  2.0 μL； ITS序列的PCR扩增条件为： 95℃预变性3min； 94℃  变性55s， 55℃退火55s， 72℃延伸 70s， 进行3 5个循环； 72℃延伸7mi n； matK序列的PCR的扩增体系为20 μL， 体系包含PCR  2× Mix 10 μL， ddH2O 8 μL， 引物各0.5 μL， 总DNA  1.0 μL； matK序列的PCR扩增条件为： 95℃预变性3min； 94℃  变性30s， 52℃退火30s， 72℃延伸 1min， 进行35个循环； 72℃延伸5mi n。 8.根据权利 要求5所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述pLB连接ITS克隆产物PCR扩增的反应体系为： 扩增体系为20 μL， 体系包含PCR  2×   Mix 10 μL， ddH2O 10 μL， 引物各0.3 μL， pLB连接菌斑1丛； 扩增条件为： 95℃预变性3min； 94℃   变性55s， 55℃退火5 5s， 72℃延伸80s， 进行3 5个循环； 72℃延伸7mi n。 9.根据权利 要求5所述的一种构建睡莲属ITS和 matK核苷酸序列数据库的方法， 其特征 在于： 所述测序反应体系 为： ITS和 matK的测序反应的反应体系和反应条件一样； 反应体系 为6 μL， 包含Bigdye  0.3 μL， SeqB uffer 0.5