(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210535655.3 (22)申请日 2022.05.17 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 丁芳　周佳乐　李泽辰　洪霓　 王国平　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 基于SEC分泌蛋白区分黄龙病菌 分子变体的 引物对及方法 (57)摘要 本发明公开了基于SEC分泌蛋白区分黄龙病 菌分子变体的引物对及方法， 所述引物的序列如 SEQ ID NO.1～2所示， 所述方法包括： 取感染黄 龙病菌的植物样品并提取其核酸， 以核酸为模 板， 使用引物进行PCR扩增， 采用凝胶电泳检测， 并根据检测结果判断分子变体的类型。 该方法具 有速度快、 准确性高、 重复性好、 稳定性高、 操作 性强等特点， 适用于不同地理来源、 不同症状表 型、 不同寄主来源、 甚至同一寄主来源不同部位 的样品中黄龙病菌分子变体的快速鉴定， 为黄龙 病遗传多态性分析提供了技 术支撑。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114934126 A 2022.08.23 CN 114934126 A 1.一种基于SEC分泌蛋白快速区分黄龙病菌分子变体的引物对， 其特征在于， 所述引物 对包括： CLas04560‑F： 5’ ‑ATGAAATCAAAAAATATTCTC‑3’； CLas04560‑R： 5’ ‑AAATGCTACGTC CCATAGCTT‑3’。 2.一种用于区分黄龙病菌分子变体的检测试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的 引物对。 3.根据权利要求2所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒中还包括PCR扩增 试剂。 4.一种黄龙病菌分子变 体的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 取染黄龙病菌的植物样品 并提取其核酸； S2、 以步骤S1所 得核酸为模板， 使用权利要求1所述引物对进行PCR扩增； S3、 采用凝胶电泳检测， 并根据检测结果判断分子变 体类型。 5.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S1所述植物样品为叶片、 果实、 花、 嫩茎、 皮或其 他含有黄龙病菌的组织部位。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S1所述提取的方法具体为： 将植 物样品先于液氮中充分研磨， 再使用植物总DNA提取 试剂盒提取样品总核酸。 7.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S2所述PCR扩增的反应体系为： 共 15 μL， 2×Master Mix 7.5 μL， 10 μmo l/ μL引物各0.2 μL， 模板DNA1.0 μL， 超纯 水余量。 8.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S2所述PCR扩增的反应条件为： 94 ℃3min； 94℃30s， 51℃3 0s， 72℃20s， 3 0个循环； 72℃5mi n。 9.根据权利 要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S3所述电泳检测的条件为： 1.2％ 琼脂糖凝胶， 电泳电压190V。 10.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 步骤S3中判定分子变体类型的方法 为： CLas04560 ‑ORF588的目标条带大小 为588bp， CLas04560 ‑ORF531目标条带大小 为531bp、 CLas04560‑ORF518目标 条带大小为518bp、 CLas045 60‑ORF474目标 条带大小为474bp。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934126 A 2基于SEC分泌蛋白区分黄龙病菌分子变体的引物对及方 法 技术领域 [0001]本发明属于黄龙病菌检测 技术领域， 具体涉及一种基于SEC分泌蛋白  CLas04560 快速区分柑橘黄龙病菌分子变 体的检测引物对、 检测试剂盒以及检测方法。 背景技术 [0002]柑橘黄龙病(Citrus  Huanglongbing,HLB)是世界范围内柑橘生产上的毁灭性病 害， 在全球50多个国家和地区盛 行危害， 造成了严重的经济损失。 该病由韧皮部限制性细菌 引起， 分为亚洲种(Candidatus  Liberibacter  asiaticus ,CLas)、 美洲种 (Ca.L.americanus,CLam)和非洲种(Ca.L.africanus,CLaf)。 其 中， CLas 在世界范围内主 要柑橘产区盛行危害， 造成了严重损失(Albrecht  et al.,2009；  Keremaneet  al.,2015； W a n g ,2 0 1 9 ；G o t t w a l d ,2 0 1 0 ) ，其 传 播 媒 介 主 要 为 亚 洲 柑 橘 木 虱 (DiaphorinacitriKuwayama)。 由于CLas无法体外纯培养， 限制了对其形态结构、 生理生化 等特性及遗传变异 等的相关研究， 而CLas遗传多样性研究有助于解析其种群基因结构和致 病分子机制， 是柑橘黄龙病综合防控策略制定不可或缺的重要参 考依据。 [0003]早期对黄龙病菌遗传多样性的研究多集中于病原菌的16S  rDNA序列(Deng et   al.,2008)、 16S/23S  rDNA间隔区序列(Din g et al.,2009)、 核糖体蛋白基因  (Planet et  al.,1995)。 首个'CLas'全基因组(Duan  et al.,2009)和噬菌体SC1和  SC2基因组序列 (Zhang et al.,2011)公布后， 对黄龙病菌遗传多样性的研究转向了以原噬菌体特定基因、 串联重复序列为标签的研究。 原噬菌体对于细菌基因组的变异非常重要， 可影响寄主的进 化和种间变异， 在揭 示黄龙病 菌遗传多样性方面发挥重要作用(Boyd  et al.,2002)。 短串 联重复序列(STR)可用来区分细菌分离株， 对于流行病学分析和了解微生物种群的遗传结 构具有重要意义(Xu  et al., 2014)。 Liu等分析了中国云南和广东两地柑橘黄龙病菌亚洲 种CLas菌株中的前噬菌体的特性， 明确了中国分离物的地区变异特点(Liu  et al.,2011)。 Omp基因的限制性酶切多态性也证明了与黄龙病菌的多态性与地域相关(Hu  et al., 2011)。 Wang等分析262个分别来自中国和美国的菌株变异区  (CLIBASIA_05640 ‑CLIBA  SIA_05650)的电泳条带类型谱， 发现2个国家之间及中国的云南和广东两省之间的分离物 具有遗传多态性， 并指出基因的插入和缺失突变是菌株遗传多样性的重要依据(Wang  et  al.,2012)。 Zhou报道了黄龙病菌基因组中的两个高度变异的前噬菌体基因， 并利用这两个 基因分析来自不同国家的  32个分离物， 证实黄龙病菌的遗传多态性与地理来源存在一定 的相关性(Zhou  et al.,201 1)。 [0004]总之， 目前柑橘黄龙病菌遗传多态性的研究均基于某些特定 的基因或区间， 现有 的研究仅证实黄龙病菌遗传多态性与地理来源存在一定 关系。 但是快速区分黄龙病菌 分子 变体的研究尚无相关报道。 发明内容 [0005]针对现有技术中的问题， 本发明利用黄龙病菌致病相关基因SEC分泌蛋白  说　明　书 1/5 页 3 CN 114934126 A 3