(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210536305.9 (22)申请日 2022.05.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114634975 A (43)申请公布日 2022.06.17 (73)专利权人 北京万泰生物药业股份有限公司 地址 102200 北京市昌平区科 学园路31号 (72)发明人 李珂　马万里　贾继宗　韩金乐　 叶祥忠　 (74)专利代理 机构 北京国谦专利代理事务所 (普通合伙) 11752 专利代理师 肖应国 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)(56)对比文件 CN 114622005 A,2022.06.14 闫璐瑶等.宿主细胞残留DNA 片段大小分 布. 《中国生物制品学杂志》 .2021,第34卷(第3 期), 审查员 吴至芳 (54)发明名称 一种检测细胞DNA含量的方法及其试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种引物和探针组合物、 同时 检测细胞DNA片段含量和大小分布的检测方法及 其试剂盒， 包括3套引物和探针， 检测反应优化设 置了40µL定量PCR反应体系， 反应程序中退火延 伸温度为60℃， 3套引物和探针单独单管检测同 一样本的小、 中、 大3类DNA片段， 灵敏度可达 0.003pg/ µL， 有效避免了假阳性 反应、 特异性高， 还可以同时分析MDC K细胞的大小分布， 远远高于 常规的标准要求。 权利要求书1页 说明书10页 序列表4页 附图6页 CN 114634975 B 2022.08.12 CN 114634975 B 1.一种引物和探针组合物， 其特 征在于： 包括3套引物和探针， 分别为： 根据MDCK细胞全基因组DNA设计小片段的正向引物XF1、 反向引物XR1和探针XP1,其核 苷酸序列依次为序列表中SEQ  ID NO:1‑3所示； 根据MDCK细胞全基因组DNA设计中片段的正向引物ZF1、 反向引物ZR1和探针ZP1,其核 苷酸序列依次为序列表中SEQ  ID NO:4‑6所示； 根据MDCK细胞全基因组DNA设计大片段的正向引物DF1、 反向引物DR1和探针DP1,其核 苷酸序列依次为序列表中SEQ  ID NO:7‑9所示； 所述探针XP1、 ZP1和DP1的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团， 所述荧光基团为FAM， 所述淬灭基团为E clipse， 并且与扩增片段的中间部分序列同源。 2.一种MDCK细胞DNA的检测方法， 其特 征在于： 所述方法包 含参与反应的权利要求1所述的引物和探针组合物； 还 包括以下步骤： 核酸提取： 提取待测样本的DNA； 制备反应体系： 制备40 µL定量PCR反应体系， 包括DNA、 dNTP混合物、 Mg2+离子、 Taq  DNA 聚合酶、 正向引物、 反向引物、 探针、 10 ×PCR Buffer和MDCK细胞DNA标准品， 余 量为水； 反应过程： 包括95℃预变性5分钟； 95℃变性15秒、 6 0℃退火延伸90秒， 40个 循环； 结果检测： 包括实时荧 光信号判读、 绘制标准曲线； 所述方法不用于疾病的诊断与治疗。 3.根据权利 要求2所述的MDCK细胞DNA的检测方法， 其特征在于： 3套所述的引物和探针 组合物分别设置在3个单独的PCR扩增管中独立进行 所述MDCK细胞DNA的检测。 4.根据权利 要求2所述的MDCK细胞DNA的检测方法， 其特征在于： 所述反应体系中， 各组 分的使用浓度或用量为2.5mM  dNTP混合物4 µL、 50mM Mg2+离子2 µL、 4U Taq DNA聚合酶0.4 µ L、 正向引物和反向引物终浓度为15uM， 探针终浓度为10uM、 10 ×PCR Buffer取  4µL、 MDCK细 胞DNA标准品10 µL， 余量用去离 子水补足40 µL。 5.一种MDCK细胞DNA的检测试剂盒， 其特征在于： 包含权利要求1所述的引物和探针组 合物、 标准品、 阴性对照、 Mg2+离 子和DNA聚合酶。 6.根据权利要求5所述的MDCK细胞DNA的检测试剂盒， 其特征在于： 所述DNA聚合酶为 Taq DNA聚合酶， 每40 µL反应体系用量 为1.6U、 所述Mg2+离 子的浓度为5 0mM， 用量 为2µL。 7.权利要求1所述的引物和探针组合物、 或者权利要求2 ‑4任一项中所述的MDCK细胞 DNA的检测方法、 或者权利要求5 ‑6任一项中所述的MDCK细胞DNA的检测试剂盒， 在检测MDCK 细胞DNA含量和大小分布中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114634975 B 2一种检测细胞DNA含量的方 法及其试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及核酸的检测方法技术领域， 具体涉及一种定量PCR(QPC R)检测方法， 尤 其是涉及一种检测细胞DNA含量的QPCR法； 本发 明还特别涉及一种检测细胞DNA含量的方法 及其试剂盒， 可以在检测细胞DNA含量和大小分布中应用， 尤其是涉及到MDCK细胞DNA含量 和大小分布的检测。 背景技术 [0002]细胞培养来源的生物制品中残留的宿主细胞  DNA具有潜在的安全风险， 故无论是 产品生产和药物监管都需要确认工艺对细胞DNA的去除程度， 尤其是终产品中残留细胞DNA 含量检测尤其重要。 2020版 《中国药典》 公示的三种方法： PicoGreen荧光法、 DNA  探针杂交 法和定量PCR法 （简称QPCR法） 是生物制剂开发中常用的DNA残留量的检测方法。 其中， 定量 PCR法为2020版 《中 国药典》 新增的方法， 也是目前最适合宿主细胞核酸定量检测的方式， 美 国药典也将 定量PCR法作为宿 主细胞残留DNA  检测的唯一推荐 方法。 文献调研也 发现， 定量 PCR法已经应用于疫苗中宿主细胞残留DNA的含量检测。 [0003]国际上的主要的监管机构对于疫苗等生物制品中的残留DNA的含量和残留片段的 大小分布等非常关注， 如中 国药典2020年版三部规定， 以细胞基质生产的生物制剂DNA残留 量不能超过100  pg/剂， 以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10  ng/剂(即 10ng/ml)； 美国FDA发布的指导原则中指出： 生物制品宿主细胞DNA残余限度为100  pg/剂， 对于大剂量生物制品如单克隆抗体， 根据其残留DNA来源及给药途径， DNA残留量可放宽至 10 ng/剂； 欧洲药典通则规定的生物制品残留DNA限度大多为不超 过10 ng/剂； 并且， WHO和 美国FDA现行指导方针推荐成品中残留DNA长度不大于200  bp （相当于一个功能基因的长 度） 。 因此疫苗生产企业质控需要检测成品中的残留DNA片段含量、 大小分布情况， 提高疫苗 产品的安全性。 [0004]MDCK细胞(Madin ‑Darby canine kidney cells， 犬肾细胞 ),1958年  Madin和 Darby从健康成年母犬(Cocker  Spaniel， 可卡犬， 一种英国的小猎犬)的肾脏组织中分离培 养建立， 后经转化而 形成传代细胞系。 MD CK细胞被广泛用作远曲小 管或集合管的模型、 用于 代谢研究和Pg级药物与药物相互作用研究， 以及观察流感病毒株对细胞功能的影响， 还被 公认为最适于甲、 乙型流感病毒疫苗生产的3种细胞系之一。 由于检测序列选择、 引物探针 设计和检测体系优化等方面存在难度， 目前， 用于定量检测MDCK细胞残留DNA检测方法和 MDCK细胞残 留DNA的片段大小分布情况的检测方法 的检测灵敏度低， 定量准确度较差等原 因未能产业化， 导致不能满足市场需求。 随着 MDCK细胞用于疫苗生产的研究越来越多， 建立 同时检测MDCK细胞残留DNA片段含量和大小分布的检测方法有重大意 义。 发明内容 [0005]本发明的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷， 提供一种新的同时检测MDCK 细胞DNA片段含量和大小分布的检测方法。说　明　书 1/10 页 3 CN 114634975 B 3