(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210563129.8 (22)申请日 2022.05.18 (71)申请人 圣湘生物科技股份有限公司 地址 410205 湖南省长 沙市高新 技术产业 开发区麓松路680号 (72)发明人 刘传　王维　王雪敏　郭鑫武　 任小梅　刘佳　戴立忠　 (74)专利代理 机构 北京派特恩知识产权代理有 限公司 1 1270 专利代理师 刘欣　蒋雅洁 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一步法检测致泻性病毒的组合物、 试剂盒、 方法及其用途 (57)摘要 本发明属于分子生物学检测领域， 具体地， 涉及检测致泻性病毒的组合物、 试剂盒、 方法及 其用途， 更具体地， 涉及一步法检测九种致泻性 病毒的组合物、 试剂盒、 方法及其用途。 本发明提 供了所述试剂组合， 包括所述试剂组合的试剂 盒， 所述试剂组合的用途以及用于检测致泻性病 毒并分型的方法。 使用本发明的试剂组合， 能够 一次性检测9种腹泻病毒， 覆盖度好。 同时， 结合 一步法核酸释放剂， 无需核酸纯化步骤， 使用粪 便样本与核酸释放剂混匀后， 短暂离心取上清直 接进行检测， 检测周期短， 操作步骤少， 灵敏度 高， 特异性 好。 权利要求书1页 说明书12页 附图3页 CN 114736991 A 2022.07.12 CN 114736991 A 1.一种一 步法检测致泻性病毒的试剂组合， 包括第一组合物： SEQ ID NO.1～27所示的引物和探针。 2.根据权利要求1所述的试剂组合， 其中， 所述试剂组合还包括第二组合物： 缓冲液、 盐 离子、 表面活性剂以及强碱 。 3.根据权利要求2所述的试剂组合， 其中， 所述缓冲液的浓度为0.1mM～800mM， 所述盐 离子的浓度为1mM～1200mM， 所述表面活性剂的体积百分比为0.05％～5％， 所述强碱的质 量浓度为1mg/mL～10 0mg/mL。 4.根据权利要求2所述的试剂组合， 其中， 所述试剂组合还包括第二组合物： Tris ‑HCl、 氯化钠、 氯化钾、 吐温20、 曲拉通X ‑100、 乙基苯基聚乙二醇和氢 氧化钠。 5.根据权利要求1所述的试剂组合， 其 中， 所述第一组合物还包括如SEQ  ID NO.28～30 所示的内标引物和探针。 6.根据权利要求1～5中任一项所述的试剂组合， 其中， 所述试剂组合的各组合物中的 各成分以混合的形式存在。 7.根据权利要求1～6中任一项所述的试剂组合在制备检测致泻性病毒并分型的试剂 盒中的用途。 8.一种一步法检测致泻性病 毒并分型的试剂 盒， 所述试剂 盒包括如权利要求1～6 中任 一项所述的试剂组合。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其中， 所述试剂盒进一步包括逆转录酶、 Taq酶、 尿嘧 啶糖基化酶、 Mg2+、 Mn2+、 Rnasin、 dNTP和PCR缓冲液。 10.一种用于以非诊断目的检测致泻性病毒并分型的方法， 所述方法包括以下步骤： 1)使用第二组合物释放待测样本的核酸； 2)使用第一组合物对步骤1)获得的核酸进行荧 光定量PCR分析； 3)获得并分析 结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114736991 A 2一步法检测致泻 性病毒的组合物、 试剂盒、 方 法及其用途 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测领域， 具体地， 涉及检测致泻性病毒的组合物、 试剂 盒、 方法及其用途， 更具体地， 涉及一步法检测九种致泻性病毒的组合物、 试剂盒、 方法及其 用途。 背景技术 [0002]腹泻是一种发病率高并流行于世界各地的胃肠道传染病， 其发病率仅次于上呼吸 道感染， 病毒性腹泻是我国的常见病和多发病， 病因比较复杂， 尤对婴幼儿人群危害更大。 致腹泻病毒的血清型众多， 临床上腹泻综合征往往是 由一种或者多种病毒共同导致。 因此 亟需建立腹泻病毒快速高效的诊断方法。 [0003]PCR‑荧光探针法操作方便， 不易污染， 灵敏度和特异性高， 相关仪器设备较为常 见。 但目前使用PCR ‑荧光探针法检测胃肠道病毒的相关试剂存在以下问题： [0004]1、 相关试剂通量低： 一次只能检测一个病原成分， 如需要检测多种病原菌， 就需要 多台PCR仪同时工作， 效率低， 周期长， 对大批量的多种 病原污染的样品更 是无从下手。 [0005]2、 相关试剂对于粪便样本需要进行提取纯化后才能进行扩增检测， 检测周期长， 操作步骤多。 如果为了缩短检测周期， 减少操作步骤而采用一步法提取核酸， 则会因为一步 法试剂的存在， 而影响PCR的扩增效果， 使得后续PCR的灵敏度和/或特异性受到影响。 [0006]因此， 本领域亟需一种能够检测多个病原成分， 同时还能够免除纯化， 减少操作步 骤， 同时能够保持PCR灵敏度和特异性的检测试剂。 发明内容 [0007]有鉴于此， 第一方面， 本发明提供一种一步法检测致泻性病毒的试剂组合， 包括第 一组合物： [0008]SEQ ID NO.1～27所示的引物和探针。 [0009]进一步地， 所述组合物还包括第二组合物， 其中， 所述第二组合物为一种包括缓冲 液的一步法核酸释放剂。 [0010]使用本发明的试剂组合， 能够一次性检测9种腹泻病毒， 覆盖度好。 同时， 结合一步 法核酸释放剂， 无需核酸纯化步骤， 使用粪便样本与核酸释放剂混匀后， 短暂离心取上清 直 接进行检测， 检测周期短， 操作步骤少， 灵敏度高， 特异性 好。 [0011]本发明中提及的 “一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术(Extraction   Free Nucleic Acid Release and Amplification  Technology,E FNART)。 其是指在不需要 对样本进 行核酸提取或纯化的情况下， 直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性 的扩增体系， 进行直接的样本核酸扩增检测。 [0012]进一步地， 第一组合物还 包括如SEQ  ID NO.28～3 0所示的内标引物和探针。 [0013]在一些具体的实施方案中， 第一组合物分为 三组： [0014]A、 轮状病毒A组、 诺如病毒GI型、 诺如病毒GI I型的引物和探针；说　明　书 1/12 页 3 CN 114736991 A 3