(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210541517.6 (22)申请日 2022.05.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114686617 A (43)申请公布日 2022.07.01 (73)专利权人 国家食品安全风险评估中心 地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里 7号 (72)发明人 韩小敏　徐文静　江涛　李凤琴　 徐进　 (74)专利代理 机构 北京秉文同创知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11859 专利代理师 张文武　陈少丽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/685(2006.01) 审查员 陈婧莘 (54)发明名称 一种黑曲霉群菌株中伏马菌素合成基因的 检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种黑曲霉群菌株中伏马菌 素合成基因的检测方法。 所述检测方法包括： 采 用第一正向引物和第一反向引物进行检测， 所述 第一正向引物的序列如序列表中SEQ  ID NO:1所 示， 所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ  ID  NO:2所示， 所述第二正向引物的序列如序列表中 SEQ ID NO:3所示， 所述第二反向引物的序列如 序列表中SEQ  ID NO:4所示。 该检测方法利用PCR 技术， 能够在黑曲霉群菌株尚未产生FB以及产FB 水平极低时进行检测， 可实现对黑曲霉群菌株产 FB污染风险的早期预警。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114686617 B 2022.08.26 CN 114686617 B 1.一种黑曲霉群菌株中伏马菌素合成基因的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法包 括： 采用第一正向引物和第一反向引物进行检测， 获得扩增产物， 所述第一正向引物的序 列如序列表中SEQ  ID NO:1所示， 所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ  ID NO:2所示， 若所述扩增产物长749bp， 则待测样品中有所述 黑曲霉群菌株中伏马菌素合成基因。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 所述检测方法包括： 提取待测样品的总DNA， 并对所述总DNA进行 纯化； 确定纯化后的所述总DNA的纯度后， 利用所述第 一正向引物和所述第一反向引物， 采用 聚合酶链式反应进行扩增， 得到扩增产物； 将所述扩增产物和核酸分子量 参照物进行琼脂糖凝胶电泳； 若所述扩增产物在749bp处， 则所述待测样品中有所述黑曲霉群菌株中伏马菌素合成 基因。 3.根据权利 要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的体系包括： 所述总DNA1～2 μL、 所述第一正向引物1.0 μL、 所述第一反向引物1.0 μL、 2 ×高保真DNA聚合酶混合物12.5 μL 和ddH2O 8.5～9.5 μL。 4.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述扩增的程序包括： 95℃预变性 2min， 30个循环， 72℃延伸5min， 每个所述循环均包括： 95℃变性20s、 58℃退火20s和72℃延 伸60s。 5.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 将所述待测样品经过培养后提取所述 总DNA。 6.根据权利要求5所述的检测方法， 其特征在于， 所述培养的  方法包括： 将所述待测样 品接种于 培养基上， 于28℃ ±1℃的恒温培 养箱中静置 培养5～7天， 得到 培养物； 挑取所述培养物接种于液体培 养基中， 于28℃ ±1℃震荡培 养24～120 h。 7.根据权利要求2所述的检测方法， 其特征在于， 所述检测方法还包括： 采用分光光度 计确定纯化后的所述总DNA的纯度。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114686617 B 2一种黑曲霉群菌株中伏马菌素 合成基因的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 更具体地， 涉及黑曲霉群菌株中伏马菌素合成基因的 检测方法。 背景技术 [0002]伏马菌素 （B  type Fumonisin， FB） 是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构 类似的双酯类化合物， FB有FA1、 FA2、 FB1、 FB2、 FB3、 FB4、 FC1、 FC2、 FC3、 FC4和FP1共11种。 FB具有 肝肾毒性， 可引起马脑软化症， 并被国际癌症研究机构 （International  Agency for  Research  on Cancer， IARC） 列为2B类致癌物。 黑曲霉群菌株是食品发酵工业常用菌种， 但 黑曲霉发酵 液中首次检测到FB以后， 黑曲霉 群菌株的安全性问题再次引发广泛关注。 [0003]目前判断菌株是否产FB的重要方法是通过测定黑曲霉群菌株发酵后是否可以产 生FB。 常采用的技术主要有色谱技术和色谱质谱联用技术等。 色谱技术和色谱质谱联用技 术虽然可以对食品或饲料中FB的污染情况进行定性或定量分析， 但采用这两种方法检测 时， 需要样本中已经产生FB或已经被FB污染到一定程度才能进行测定， 但在黑曲霉菌株尚 未产生FB或产FB水平极低时是无法检测到的， 更是无法实现对黑曲霉菌株产FB污染风险进 行预测并实现早期预警的。 发明内容 [0004]为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种黑曲霉群菌株中伏马 菌素合成基因的 检测方法。 [0005]本发明实施例提供了一种黑曲霉群菌株中伏马菌素合成基 因的检测方法， 所述检 测方法包括： [0006]采用第一正向引物和第一反向引物进行检测， 所述第一正向引物的序列如序列表 中SEQ ID NO:1所示， 所述第一反向引物的序列如序列表中SEQ  ID NO:2所示。 [0007]具体地， 所述检测方法还包括： 第二正向引物和第二反向引物， 所述第二正向引物 的序列如序列表中SEQ  ID NO:3所示， 所述第二反向引物的序列如序列表中SEQ  ID NO:4所 示。 [0008]具体地， 所述检测方法包括： [0009]提取待测样品的总DNA， 并对所述总DNA进行 纯化； [0010]确定纯化后的所述总DNA的纯度后， 利用所述第一正向引物、 所述第一反向引物、 所述第二 正向引物和所述第二反向引物， 采用聚合酶链式反应进行扩增， 得到扩增产物； [0011]将所述扩增产物和核酸分子量 参照物进行琼脂糖凝胶电泳， 得到扩增片段； [0012]若所述扩增片段在749bp处， 则所述待测样品中有所述黑曲霉群菌株中伏马菌素 合成基因。 [0013]具体地， 所述扩增的体系包括： 所述总DNA  1～2 μL、 所述第一正向引物1.0 μL、 所述 第一反向引物1.0 μL、 所述第二正向引物1.0 μL、 所述第二反向引物1.0 μL、 2 ×高保真DNA聚说　明　书 1/4 页 3 CN 114686617 B 3