(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210558131.6 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 海南波莲水稻基因科技有限公司 地址 570125 海南省海口市美兰区南宝路 36证券大厦9 楼 (72)发明人 李燕群　李佳林　刘功朋　郑秋菊　 庄礼捷　李新鹏　曾翔　吴永忠　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 商秀玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测植物内、 外源基因的分子标记、 引物组 和方法 (57)摘要 本发明涉及植物分子遗传育种技术领域， 具 体涉及检测植物内、 外源基因的分子标记、 引物 组和方法。 本发明提供用于检测植物内、 外源 CYP704B2基因的引物组， 该引物组包 括外源转基 因检测引物组和内源基因检测引物组； 所述外源 转基因检测引物组包 括具有如SEQ  ID NO.1‑3所 示的核苷 酸序列的引物； 所述内源基因检测引物 组包括具有如SEQ  ID NO.4‑6所示的核苷酸序列 的引物。 利用该引物组及其对应的KASP检测方法 对植物样品进行外源转基因成分和 内源基因的 检测具有准确率高、 通量高、 成本低等优点， 具有 较好的应用价 值。 权利要求书3页 说明书11页 序列表3页 附图3页 CN 114959095 A 2022.08.30 CN 114959095 A 1.检测植物内、 外源CYP704B2基因的分子标记， 其特征在于， 所述分子标记包括外源转 基因分子标记K ‑1和内源基因分子标记K ‑2； 所述分子标记K ‑1由核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物扩增得到； 所述分子标记K ‑2由核苷酸序列如SEQ  ID NO.4‑6所示的引物扩增得到 。 2.用于检测植物内、 外源CYP704B2基因的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括外源转 基因检测引物组和内源基因检测引物组； 所述外源转基因检测引物组包括具有如SEQ  ID NO.1‑3所示的核苷酸序列的引物； 所述内源基因检测引物组包括具有如SEQ  ID NO.4‑6所示的核苷酸序列的引物。 3.根据权利要求2所述的引物组， 其特征在于， 具有如SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序列 的引物与具有如SEQ  ID NO.2所示的核苷酸序列的引物的5 ’端分别被荧光基团标记， 且两 条引物标记的荧 光基团是不同的； 具有如SEQ  ID NO.4所示 的核苷酸序列的引物与具有如SEQ  ID NO.5所示 的核苷酸序 列的引物的5 ’端分别被荧 光基团标记， 且两条引物标记的荧 光基团是不同的。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包 含权利要求2或3所述的引物组； 优选地， 所述试剂盒还包含选自用于KASP反应的缓冲液、 DNA聚合酶、 dNTP、 Mg2+、 荧光染 料、 淬灭基团中的一种或多种。 5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂 盒在植物育种或种质资源改良中的应用。 6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂 盒在检测植物所含C YP704B2基因的基因型或预测植物花粉育性中的应用。 7.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂 盒在检测植物是否含有转基因成分或转基因产品检测中的应用； 所述转基因成分为修饰的CYP 704B2基因， 所述修饰的CYP 704B2基因与野生型CYP 704B2 基因相比， 含有第839位A突变为C的突变。 8.根据权利要求5～7任一项所述的应用， 其特征在于， 所述植物为水稻、 玉米、 大豆、 小 麦、 大麦、 小米或高粱。 9.一种检测水稻内、 外源CYP704B2基因的方法， 其特征在于， 所述方法包括： 以待测水 稻的DNA为模板， 采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组和/或核苷酸序列如SEQ   ID NO.4‑6所示的引物组进行KASP反应， 得到PCR产物， 检测PCR产物的荧光信 号， 根据荧光 信号的类型判断待测水稻所含内、 外源C YP704B2基因的基因型； 其中， 核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示的引物与核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示的引物 的5’端分别被荧 光基团标记， 且两条引物标记的荧 光基团是不同的； 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示 的引物与核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示的引物的5 ’ 端分别被荧 光基团标记， 且两条引物标记的荧 光基团是不同的。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述根据荧光信号的类型判断待测水稻 所含内、 外源C YP704B2基因的基因型为： 采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组检测水稻是否含有外源CYP704B2基因 转基因成分及其基因型， 若只检测到SEQ  ID NO.2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻含有转基因成分， 基因型为msmsT， 花粉育性为一半可育一半不育； 若只检权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114959095 A 2测到SEQ ID NO.1所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻不含有转基因 成分， 基因型为MsMs或Msms， 花粉育性为完全可育； 若同时检测到SEQ  ID NO.1和2所示引物 所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻含有转基因成分， 基因型为MsMsT或MsmsT， 花粉育性为完全 可育； 若SEQ  ID NO.1和2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号均检测不 到， 则判断待测水稻不含有转基因成分， 基因型为m sms， 花粉育性 为完全败育或无花粉； 或者， 采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.4‑6所示的引物组检测水稻内源CYP704B2基因的 基因型， 若只检测到SEQ  ID NO.5所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻 的CYP704B2 基因型为msms， 花粉育性完全败育或无花粉； 若只检测到SEQ  ID NO.4所示引物 所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断样品基因型为M sMs， 花粉育性为完全可育； 若同时检 测到SEQ ID NO.4和5所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻基因型为 MSms， 花粉育性 为完全可育； 或者， 同时采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组和核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4‑6所示的引物组检测水稻是否含有外源CYP704B2基因转基因成分及其基因型以及内 源CYP704B2 基因的基因型， 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到 的PCR产物中只检测到S EQ ID NO.1所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸 序列如SEQ  ID NO.4‑6所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中只检测到SEQ  ID NO.4所示 引物所含荧光基团对应的荧光信号， 则判断待测水稻不含转基因成分， 基因型为MsM s， 花粉 完全可育； 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中同时检测 到SEQ ID NO.1和2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4‑6所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中检测到SEQ  ID NO.4所示引物所含荧光基团 对应的荧 光信号， 则判断待测水稻含有转基因成分， 基因型为MsMsT， 花粉完全可育； 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中未检测到 SEQ ID NO.1和2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4‑6所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中检测到SEQ  ID NO.5所示引物所含荧光基团 对应的荧光信号， 则判断待测水稻不含转基因成分， 基因型为msms， 花粉完全败育或无花 粉； 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中只检测到 SEQ ID NO.2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.4‑6 所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中只检测到SEQ  ID NO.5所示引物所含荧光基团对应 的荧光信号， 则判断待测水稻含转基因成分， 基因型为msmsT， 花粉育性为一半可育一半不 育； 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中只检测到 SEQ ID NO.1所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.4‑6 所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中同时检测到SEQ  ID NO.4和5所示引物所含荧光基 团对应的荧 光信号， 则判断待测水稻不含转基因成分， 基因型为MSm s， 花粉完全可育； 若采用核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑3所示的引物组进行PCR得到的PCR产物中同时检测 到SEQ ID NO.1和2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号， 且采用核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4‑6