(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210555860.6 (22)申请日 2022.05.19 (71)申请人 安徽农业大 学 地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西 路130号 (72)发明人 李亮　孙裴　李杰　秦娟　陈丽君　 高亚飞　杨勇　蒋广志　何长生　 王军　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 薛红凡 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的引 物组、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于双重NanoPCR检测 SVA和EMCV的引物组、 试剂盒及其应用， 属于病毒 检测技术领域。 本发明提供的双重NanoPCR检测 SVA和EMCV的引物， 包括塞内卡病毒A检测引物 SVAF/SVA  R和脑心肌炎病毒检测引物EMCV  F/ EMCV R。 本发明所述方法特异性强、 灵敏度高、 操 作简便。 权利要求书1页 说明书9页 序列表1页 附图6页 CN 114921590 A 2022.08.19 CN 114921590 A 1.一种基于双重N ano PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物组， 其特征在于， 包 括塞内卡病毒A检测引物SV AF/SVAR和脑心肌炎病毒检测引物E MCVF/EMCV R； 所述SVAF的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； 所述SVAR的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述EMCVF的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示； 所述EMCV R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 2.权利要求1所述引物组在制备同时检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒中的 应用。 3.一种基于双重PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括权 利要求1所述引物组。 4.根据权利要求3所述试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括2 ×Taq PCRMasterMix 和金纳米颗粒。 5.根据权利要求3或4所述试剂盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括病毒RNA提取试剂和 反转录试剂。 6.权利要求1所述引物 组或权利要求2～5任意一项所述试剂 盒在非诊断目的的检测塞 内卡病毒A和/或脑 心肌炎病毒中的应用。 7.一种非诊断目的的检测塞内卡病毒A和/或脑心肌炎病毒的方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： 1)提取样本RNA； 2)将步骤1)中提取的样本RNA经反转录， 得到 cDNA； 3)以步骤2)中所述cDNA为模板， 以权利要求1所述引物组进行双重Nano  PCR检测， 得到 PCR产物； 4)将步骤3)中所述PCR产物进行条带分析， 根据是否出现预期的条带判断样本是否塞 内卡病毒A和/或脑 心肌炎病毒。 8.根据权利要求7所述方法， 其特征在于， 步骤2)中所述双重N ano PCR检测的反应体系 为25 μL： 10 μmol/L  SVA F和10 μmol/LSVA  R各1.25 μL， 10 μmol/LEMCV  F和10 μmol/LEMCV  R各 1.25 μL， 2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、 0.05mg/ml金纳米颗 粒0.5 μL、 病毒cDNA2 μL和水5 μ L。 9.根据权利要求7所述方法， 其特征在于， 步骤2)中所述双重N ano PCR检测的反应程序 为95℃3mi n； 95℃30s， 50.4℃30s， 72℃， 25s， 3 0个循环； 72℃5mi n。 10.根据权利要求7～9任意一项所述方法， 其特征在于， 所述样本中含塞内卡病毒A 的 拷贝数不低于9.45 ×103copies/μL； 所述样本中含脑心肌炎病毒的拷贝数不低于8.77 × 103copies/ μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921590 A 2一种基于双重Na noPCR检测SVA和EMCV的引物组、 试剂盒及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于病毒检测技术领域， 具体涉及一种基于双重NanoPCR检测SVA和EMCV的 引物组、 试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]塞内卡病毒A(Senecavirus  A,SVA)是小核糖核酸病毒科、 塞内卡病毒属唯一成 员， 又称为塞尼卡谷病毒。 近年来的众多研究都表明SVA与猪原发性水疱病和新生仔猪死亡 率升高密切相关， 感染SVA的患猪表现出厌食、 发热、 跛行等症状， 口腔黏膜、 鼻等出现完整 或破裂的小泡， 蹄壁以及冠状带出现溃疡性病变， 感染SVA的新生仔猪死亡率显著增加。 SVA 可以感染所有日龄的猪， 且没有明显的季节性， 四季皆可发生， 以春秋多发。 目前该病大多 为散发。 猪是本病毒的宿 主。 老鼠和苍蝇是重要的病毒携带者， 在病毒的传播过程中起到重 要的作用。 [0003]脑 心 肌 炎 (E n c e p h a l o m y o c a rd i t i s ,E M C) 是由 脑 心 肌 炎 病 毒 (Encephalomyocarditis  virus,EMCV)引起的一种以脑炎、 心肌炎和繁殖障碍为主要临诊 特征的人畜共患传染病。 自然条件下， EMCV可以感染家畜、 啮齿类动物、 野生动物以及灵长 类动物， 其中啮齿类动物是其自然储存宿主和主要传播者。 猪是被该病毒感染和危害最严 重的家畜， 妊娠母猪感染后可致流产、 产死胎和弱仔， 仔猪感染后可致致死性心肌炎和脑炎 等。 [0004]目前， 针对SVA或EMCV国内外已建立多种检测方法， SVA的基因组特征与心病毒属 的成员非常相似。 有学者对SVA和EMCV保守多肽区分析发现， SVA的P1、 2C、 3C和3D多肽与心 病毒属的P1、 2C、 3C和3D多肽的遗传关系 最为密切， 这2种病毒在 临床上也不排除有混合感 染的可能性。 因此， 同时检测SV A和EMCV对于早期疾病诊断是非常的必要。 [0005]然而， 目前还未有 关于同于检测SVA和EMCV技术的报道， 严重制 约了猪养殖业的健 康发展。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本 发明的目的在 于提供一种基于双重NanoPC R检测塞内卡病毒A和脑心 肌炎病毒的引物组、 试剂盒及其应用。 [0007]本发明提供了一种基于双重Nano  PCR检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的引物 组， 包括塞内卡病毒A检测引物SV AF/SVAR和脑心肌炎病毒检测引物E MCVF/EMCV R； [0008]所述SVAF的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1所示； [0009]所述SVAR的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 2所示； [0010]所述EMCVF的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3所示； [0011]所述EMCV R的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 4所示。 [0012]本发明提供了所述引物组在制备同时检测塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒的试剂盒说　明　书 1/9 页 3 CN 114921590 A 3