ICS 07.100.99 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2076—2021 动物垫料中绿脓杆菌检测 Detection of Pseudomonps aeruginosa in animal bedding 2021-01-25 发布 2021-02-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2076—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、二连浩特市疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：赵治国、敖威华、杨帆、延涵、王海艳、陈林军、崔强、韩祎陟、靳木子、郭 文丽、马彩霞。 I DB15/T 2076—2021 动物垫料中绿脓杆菌检测 1 范围 本文件规定了动物垫料中绿脓杆菌的定性检测方法。 本文件适用于动物垫料中绿脓杆菌定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。 注： 包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。 4 设备和材料 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 冰箱：2 ℃～5 ℃。 全自动细菌鉴定系统。 飞行时间质谱仪。 二级生物安全柜。 天平：感量 0.1 g。 pH 计。 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度） 、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 高压灭菌器。 无菌量筒：250 mL。 无菌试管：18 mm×180 mm。 均质器及灭菌带滤膜的均质袋。 1 DB15/T 2076—2021 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 恒温培养箱：36℃±1℃。 无菌接种针、接种环。 光学显微镜。 无菌培养皿：15 mm×90 mm。 无菌试管：18 mm×180 mm。 无菌棉签。 无菌镊子。 无菌剪刀。 无菌勺。 无菌载玻片。 5 培养基和试剂 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 实验用水：符合 GB/T 6682 的要求。 SCDLP 增菌液：见附录 A 中 A.2。 假单胞菌 CFC 选择性培养基：见附录 A 中 A.3。 假单胞菌 CN 选择性培养基：见附录 A 中 A.4。 氧化酶试验：见附录 A 中 A.5。 革兰氏染液：见附录 A 中 A.6。 绿脓菌素培养液：详见详见附录 A 中 A.7。 硝酸盐蛋白胨水培养基：见附录 A 中 A.8。 明胶液化培养基：见附录 A 中 A.9。 营养琼脂：见附录 A 中 A.10。 生化鉴定试剂盒。 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。 飞行时间质谱仪靶板。 绿脓杆菌标准菌株 ATCC 27853，或等效菌株。 6 检验程序 绿脓杆菌检验程序见图1。 2 DB15/T 2076—2021 样品制备 2 检样 25 g 或 25 cm 样液+225 mL SCDLP 增菌 36 ℃±1 ℃，24 h± 2 h CFC 和 CN 平板 挑取可疑菌落，接种营养琼脂平板 36 ℃±1 ℃，18 h～24 h 革兰氏染色 全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪鉴定 氧 绿 硝 明 4 胶 2 液 ℃ 化 生 酸 化 脓 酶 菌 试 素 盐 还 原 产 验 试 气 长 报告 图1 绿脓杆菌检验程序 3 DB15/T 2076—2021 7 操作步骤 7.1 取样 7.1.1 取样原则 应遵循随机性、代表性的原则。取样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 7.1.2 样品处理 7.1.2.1 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少250 g，充分混匀后无菌称取25 g颗粒状或 粉末状垫料样品，加入225 mL SCDLP，充分振摇或均质1 min～2 min，置36 ℃±1 ℃培养24 h±2h。 7.1.2.2 平面垫料样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cmÍ5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理 盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去 棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL 无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小 重复取样 1～4 个规格板面积，相应地将棉拭子头置入 25 mL～100 mL 的无菌稀释液中，充分振摇制成 样品原液（1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2） ，取样量见表 1。取 25 mL 样品原液加入 225 mL SCDLP， 充分振摇或均质 1 min～2 min，置 36 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。 表1 不同面积平面类垫料样品取样量 样品面积 m 2 取样量 cm 2 规格板数 小于0.25（含） 25 1 0.25～0.5（含） 50 2 0.5～0.75（含） 75 3 大于0.75 100 4 7.2 分离培养 用灭菌接种环取 SCDLP 增菌液，分别划线接种于 CFC 平板和 CN 平板，于 36 ℃±1 ℃分别培养 24 h ±2 h，观察菌落形态。绿脓杆菌在这两种平板上通常呈现圆形、平滑、湿润的黄绿色菌落，在紫外光 照射下可观察到荧光。少数不形成黄绿色菌落，但有特殊芳香气味。从每个平板上挑取 5～10 个（若少 于 5 个则全部挑取）可疑菌落，分别接种到营养琼脂平板培养基上，36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，取 纯培养物进行鉴定。 7.3 鉴定 7.3.1 革兰氏染色镜检 挑取营养琼脂平板培养基上的纯培养物，进行革兰氏染色镜检，绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌。 4 DB15/T 2076—2021 7.3.2 生化鉴定 7.3.2.1 氧化酶试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，进行氧化酶试验，绿脓杆菌氧化酶试验结果呈阳性。 7.3.2.2 绿脓菌素试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物,接种在绿脓菌素测定培养基上,置 36 ℃±1 ℃ 培养 24h±2h , 加入三氯甲烷3 mL～5 mL,充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于三氯甲烷液内,待三氯甲烷提取液呈蓝 色时,用吸管将三氯甲烷提取液移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL,振荡后,静置片刻。如上层盐酸 液内出现粉红色到紫红色时判为阳性,表示被检样品中有绿脓菌素存在。若结果为阴性，则继续进行硝 酸盐还原产气试验、明胶液化试验和42 ℃生长试验。 7.3.2.3 硝酸盐还原产气试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，接种到硝酸盐蛋白胨水中，置36 ℃±1 ℃分别培养24h±2h，小 导管中有气体产生，判为阳性。 7.3.2.4 明胶液化试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，划线接种到明胶培养基中，置36 ℃±1 ℃培养24h±2h，取出放 2 ℃～8 ℃冰箱10 min～30 min，仍呈溶液状为明胶液化试验阳性，凝固不溶为阴性。 7.3.2.5 42℃生长试验 挑取营养琼脂平板上的纯培养物，接种到普通营养琼脂斜面培养基上，置42 ℃±1 ℃培养24h～48h， 能生长判为阳性。 7.3.2.6 绿脓杆菌生化特征 绿脓杆菌生化特征见表2。或可用生化鉴定试剂盒进行绿脓杆菌生化鉴定，具体操作依据绿脓杆菌 生化鉴定试剂盒说明书。 表2 绿脓杆菌生化特征 生化试验 绿脓杆菌 氧化酶 + 绿脓菌素试验 +/- 硝酸盐还原产气 + 明胶液化 + 42℃生长 + 注：“+”表示阳性； “−”表示阴性。 7.3.3 辅助鉴定 可根据实验室情况，选用全自动细菌鉴定系统或飞行时间质谱仪等进行鉴定，具体操作依据标准 GB/T 33682 和设备操作规范进行。 8 结果报告 5 DB15/T 2076—2021 综合生化鉴定结果和辅助鉴定结果，报告25 g（cm2）动物垫料样品中检出或未检出绿脓杆菌。 9 生物安全措施 为了保护实验人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489 的有关规定执行。 10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 ℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。 6 DB15/T 2076—2021 附 录 A （规范性） 培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成 培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。 A.2 SCDLP 增菌液 A.2.1 成分 酪蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 卵磷脂 吐温-80 蒸馏水 17.0 g 3.0 g 5.0 g 2.5 g 2.5 g 1.0 g 7.0 g 1000mL A.2.2 制法 将上述各成分加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.2～7.3，分装适宜容器，121 ℃高压灭菌20 min。 A.3 假单胞菌 CFC 选择性培养基 A.3.1 基础培养基 A.3.1.1 成分 蛋白质 20.0g 硫酸钾 氯化镁 十六烷三甲基溴化胺 琼脂 丙三醇 蒸馏水 10.0 g 1.4g 0.3g 13.6g 10mL 1000m A.3.1.2 制法 除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，调节pH至7.2±0.2加热溶解，分装适宜容器，121 ℃高压 灭菌15min，备用。 A.3.2 CFC添加剂 A.3.2.1 成分 十六烷三甲基溴化胺 头孢菌素 5.0mg 25.0mg 7 DB15/T 2076—2021 夫西地酸 50.0mg A.3.2.2 制法 取无菌水和无水乙醇各1mL混合均匀，将上述成分溶解于混合液中，摇匀备