ICS 11.020 DB32 C 62 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.14—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 14 部分：N 亚基因组荧光 PCR 检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 14: Real-time fluorescence PCR test N subgenomic RNA procedure 2021 -12-09 发布 江苏省市场监督管理局 2022 -01-09 实施 发 布 DB32/T 3762.14—2021 目 前 次 言 ............................................................................................................................................................ II 1 范围 .............................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件 .......................................................................................................................................... 1 3 术语和定义 .................................................................................................................................................. 1 4 环境与设施 .................................................................................................................................................. 1 5 设备与耗材 .................................................................................................................................................. 1 6 试剂与材料 .................................................................................................................................................. 1 7 样本前处理与核酸提取 .............................................................................................................................. 2 8 扩增体系配制与扩增 .................................................................................................................................. 2 9 结果判定 ...................................................................................................................................................... 2 10 附录 A ........................................................................................................................................................... 3 I DB32/T 3762.14—2021 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。 ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定； ——第13部分：叠氮溴化丙锭-荧光PCR检测程序； ——第14部分：N亚基因组荧光PCR检测程序； ——第15部分：血清/血浆IgM和IgG抗体磁微粒化学发光法检测程序； ——第16部分：核酸数字PCR法； ——第17部分：核酸检测用假病毒阳性质控品； ——第18部分：规模化核酸检测程序。 本文件为DB32/T 3762 的第14部分。 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：江苏省疾病预防控制中心、无锡市疾病预防控制中心、镇江市疾病预防控制中心、 常州市疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：朱小娟、崔仑标、朱宝立、葛以跃、吴涛、吴斌、赵康辰、乔乔、陈银、肖勇、 徐虹、王凤鸣。 II DB32/T 3762.14—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 14 部分：N 亚基因组荧光 PCR 检测程序 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒 N 亚基因组荧光 PCR 检测环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样 本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。 本文件适用于新型冠状病毒 N 亚基因组荧光 PCR 检测，为判断样本中的新型冠状病毒是否具有感 染性提供辅助手段。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本 文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 3 术语和定义 3.1 亚基因组 RNA subgenomic RNA，SgRNA 在结构上由病毒5’UTR区Leader序列及各基因转录RNA片段构成，亚基因组的出现可反应病毒复制 状态，从而代表病毒的感染性。 4 环境与设施 同 DB32/T 3762.3 的4.1条和4.2条。 5 设备与耗材 同 DB32/T 3762.3 的5.1条和5.2条。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 病毒核酸提取试剂盒。 6.1.2 实时荧光 PCR 检测试剂。 6.2 引物与探针 1 DB32/T 3762.14—2021 新型冠状病毒N亚基因组的荧光定量 PCR 引物、探针组合物（序列见附录A），其中探针的5’端 标记的是FAM荧光报告基团，3’端标记的是BHQ1荧光淬灭基团。阴性对照为DEPC水、阳性对照为含N 亚基因组片段的质粒（序列见附录A）。 6.3 材料 同 DB32/T 3762.3 的6.2条。 7 样本前处理与核酸提取 同 DB32/T 3762.3-2020 的7.1条和7.2条。 8 扩增体系配制与扩增 8.1 采用实时荧光 PCR 检测试剂，根据试剂说明书配制荧光 PCR 扩增体系，N 亚基因组反应体系中 上/下游引物（20 μmol/L）0.4 μL/ 0.4 μL，探针（10 μmol/L）0.4 μL 每个反应体系中加入模板 RNA 4 μL (或阳性、阴性对照)、无 RNAase 灭菌水加至 20 μL。 8.2 按以下参数进行荧光 PCR 扩增（具体扩增条件可根据实时荧光 PCR 检测试剂进行调整），42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 sec，45 个循环的 95 ℃ 5 sec，55 ℃ 34 sec，在每个 55 ℃反应结束时收集荧光信号。 9 结果判定 9.1 阈值设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。 9.2 质控标准 9.2.1 一般要求 检测结果中的阴、阳性对照均符合以下情况，如对照不成立，此次试验视为无效。 9.2.2 阴性对照 阴性对照无扩增曲线，或 Ct 值大于40。 9.2.3 阳性对照 阳性对照出现典型的扩增曲线呈 S 型，且 Ct 值小于或等于35。 9.3 结果判断 9.3.1 阳性判定：检测样本 N 亚基因组的 Ct 值小于或等于 40，并有明显扩增曲线，则判定为亚基因 阳性。 9.3.2 阴性判定：在对照成立下，如果检测样本 N 亚基因组没有出现扩增曲线，或 Ct 值大于 40，则 判定为亚基因阴性。 9.3.3 不确定结果：在对照成立下，如果检测样本 N 亚基因组扩增曲线不典型，结果不确定，建议重 复检测。 2 DB32/T 3762.14—2021 AA 附 录 A （规范性附录） 新型冠状病毒 N 亚基因组实时荧光 PCR 引物与探针序列及阳性对照片段序列 A.1 表A.1 中给出了新型冠状病毒N亚基因组实时荧光PCR检测的引物与探针及阳性对照片段序列。 表A.1 新型冠状病毒 N 亚基因组实时荧光 PCR 引物与探针序列及阳性对照片段序列 引物名称 引物序列(5'to3') 长度（bp） nCov-SgRNA N-F ACCAACTTTCGATCTCTTGTAGA 23 nCov-SgRNA N-R TGAGGGTCCACCAAACGTA 19 nCov-SgR