ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVDA 4—2022 动物中东呼吸综合征冠状 病毒中和抗体检 测技术 Detecting technique of neutralization antibody against MERS -CoV in animals 2022 - 07 - 19发布 2022 - 07 - 25实施 中国兽药协会 发布 T / C V D A 全国团体标准信息平台 T/CVDA 4—2022 I 目 次 前言 ................................ ................................ ................ II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 缩略语 ................................ ................................ ............. 1 4 试剂和材料 ................................ ................................ ......... 1 5 器材和设备 ................................ ................................ ......... 2 5.1 器材 ................................ ................................ ........... 2 5.2 设备 ................................ ................................ ........... 2 6.动物血清 ................................ ................................ ........... 2 6.1 样品采集 ................................ ................................ ....... 2 6.2 样品制备 ................................ ................................ ....... 2 6.3 样品处理 ................................ ................................ ....... 2 7 VNT试验操作 ................................ ................................ ........ 2 7.1 安全防护 ................................ ................................ ....... 2 7.2 材料准备 ................................ ................................ ....... 3 7.3 检测操作 ................................ ................................ ....... 3 8 结果观察与判定 ................................ ................................ ..... 4 8.1 染色结果观察 ................................ ................................ ... 4 8.2 结果判定 ................................ ................................ ....... 4 全国团体标准信息平台 T/CVDA 4—2022 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2020给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中国兽药协会提出并归口管理，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所起草。 本标准主要起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、宁夏大学、中牧实业股份有限公司。 本标准主要 起草人：步志高，刘任强，温志远，山丹，龚振兴，张蕾，华荣虹，葛金英，王喜军， 王翀。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/CVDA 4—2022 1 动物中东呼吸综合征冠状 病毒中和抗体检测技术 1 范围 本标准规定了用于动物东呼吸综合征病毒 血清中和抗体定量测定的病毒中和试验（ VNT）的实验操 作方法及结果判定 标准。 本标准适用于动物血清中中东呼吸综合征冠状病毒中和抗体的定性 检测和定量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ）适用于本文件。 GB /T 1.1 -2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则。 GB/T6682 —2008 分析实验室用水规格和试验方法。 GB19489—2008 实验室生物安全通用要求。 GB14922-94：实验动物微生物学和寄生虫学检测等级（啮齿类和兔类） 。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MERS：中东呼吸综合征（ Middle East respiratory syndrome ）； VNT：病毒中和试验（ viral neutralization test ）； BSL-2：生物安全 2级实验室（ Biosafety Laboratory Level2 ）； DMEM：细胞基础培养基（ Dulbecco's Eagle ’s Minimum Essential Medium ）； PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate -Buffered Saline ）； TCID 50：半数组织培养感染量（ Median Tissue Culture Infective Dose ）； VSV：水泡性口炎病毒（ Vesicular Stomatitis Virus ）； eGFP：增强绿色荧光蛋白（ enhanced green fluorescent protein ）； S protein ：纤突蛋白（ spike protein ）。 4 试剂和材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 4.1 水：GB/T6682 -2008，ddH2O。 4.2 中东呼吸综合征冠状病毒抗体阴性血清，为利用 ELISA和RT-PCR方法验证均为阴性的骆驼阴性血清 （由标制单位提供）。 4.3 中东呼吸综合征冠状病毒抗体阳性血清，为 rLa-MERSs重组新城疫病毒两次免疫骆驼 2w后收集的阳 性血清（由标制单位提供）。 4.4 稀释用DMEM（见 A.1）。 4.5 细胞培养用 DMEM（见 A.2）。 4.6 细胞培养用抗生素溶液（见 A.3）。 4.7 Vero E6 细胞（由标制单位提供）。 全国团体标准信息平台 T/CVDA 4—2022 2 4.8 重组水泡性口炎病毒毒株 VSVΔG-MERSs-eGFP（由标制单位提供）：以水泡性口炎病毒 Indiana毒株 为载体，缺失自身 G蛋白，同时表达中东呼吸综合征病毒 S蛋白和eGFP，滴度应≥ 105.0TCID 50/mL。 5 器材和设备 5.1 器材 5.1.1 8道移液器 50 μL~200 μL（± 2%）。 5.1.2 细胞培养板：96孔微量平底培养板。 5.1.3 细胞计数器。 5.1.4 U型底 96孔板。 5.1.5 细胞培养瓶离心管（ 1.5 mL，15 mL，50 mL）；吸头（20 μL~200 μL）。 5.2 设备 5.2.1 恒温培养箱： 37 ℃ 5% 二氧化碳培养箱。 5.2.2 显微镜： 倒置荧光显微镜。 5.2.3 冰箱：普通冰箱和超低温冰箱。 5.2.4 BSL-2级生物安全柜。 5.2.5 离心机。 5.2.6 恒温水浴箱。 6.动物血清 6.1 样品采集 动物血清采集时应做好个人防护（带 N95口罩、手套，穿生物安全防护服） ，配备含 75%酒精、碘 伏、止血绷带的应急处理箱。 6.2 样品制备 无菌静脉采集动物血液 不少于 2 mL，37 ℃静置 60min。4 ℃放置 1h至过夜后 ，6000 r/min离心 5 min， 收集上清 ，-20 ℃以下保存待检。样品采集应详细记录相关信息。