(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210663049.X (22)申请日 2022.06.13 (71)申请人 贵州医科 大学 地址 550025 贵州省贵阳市花溪区花溪大 学城栋青路2号 (72)发明人 沈茂　田晓滨　 (74)专利代理 机构 北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 专利代理师 赵红霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) G01N 33/574(2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 45/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移 的方法及应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 公开了KCNJ2/ HIF1α正反馈环路促进骨 肉瘤转移的方法及应 用， 缺氧下骨肉瘤组织的KCNJ2的表达 水平上调， KCNJ2与HIF1α结合， 减少蛋白酶体对HIF1α的 降解， 维持细胞中HIF1α的蛋白水平， 促进HIF1 α的核转位； 在增强HIF1α相关基因表达水平的 同时， 与KCNJ2的启动子结合， 上调KCNJ2的表达 水平， 形成正 反馈调节 机制， 导致HIF 1α和KCNJ2 持续上调， 进而增强骨肉瘤细胞的转移能力。 本 发明以骨肉瘤为对象， 证明KCNJ2 /HIF1α相互作 用及其对HIF1α的结合保护作用， 挖掘了新的 HIF1α调控机制， 为临床治疗骨肉瘤提供可行的 治疗靶点以及治 疗策略。 权利要求书3页 说明书15页 附图5页 CN 115074440 A 2022.09.20 CN 115074440 A 1.一种KCNJ2在制备治疗骨肉瘤靶点药物中的用途。 2.如权利要求1所述的用途， 其特征在于， 缺氧下， KCNJ2与 HIF1α 结合， 形成KCNJ2/HIF1 α 正反馈环路， 在制备增强骨肉瘤 细胞的转移能力药物上的应用。 3.一种如权利 要求1～2任意一项所述用途中KCNJ2/HIF1α 正反馈环路促进骨肉瘤转移 的方法， 其特 征在于， 所述KCNJ2/ HIF1α 正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括： 缺氧下， 骨肉瘤组织的KCNJ2的表达水平上调， KCNJ2与HIF1α结合， 减少蛋白酶体对 HIF1α 的降解， 维持细胞中HIF1α 的蛋白水平， 促进HIF1α 的核转位； 在增强HIF1α相关基因表 达水平的同时， 与KCNJ2的启动子结合， 上调KCNJ2的表达水平， 从而形成正反馈调节机制， 导致HIF1α 和KCNJ2持续上调， 进 而增强骨肉瘤 细胞的转移能力。 4.如权利要求3所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法， 其特征在于， 所述KCNJ2/ HIF1α 正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法包括以下步骤： 步骤一， 分析 KCNJ2在骨肉瘤中的表达； 步骤二， KCNJ2对骨肉瘤 细胞转移的功能学分析； 步骤三， KCNJ2调控HIF1α 蛋白稳定性及下游靶基因表达分子 机制分析； 步骤四， 缺氧 条件下， KCNJ2受HIF1α 转录调控的分子 机制分析。 5.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法， 其特征在于， 所述步骤一中的KCNJ2在 骨肉瘤中的表达包括： (1)从GEO数据库下载包含转移能力强和转移能力弱的骨肉瘤细胞系的基因表达谱分 析在骨肉瘤转移能力强的细胞系中高表达的基因， 鉴定KCNJ2在骨肉瘤强转移和弱转移的 细胞系中的表达； (2)收集骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织， 免疫组化检测KCNJ2在骨肉瘤组织以及癌旁 组织的表达； (3)培养正常成骨细胞hFOB1.19、 低转移能力细胞系U2OS和MG63、 高转移能力细胞系 143B和MMNG， 免疫印迹检测KCNJ2在 细胞系中的蛋白表达水平； (4)根据临床 资料， 将收集的骨肉瘤组织分为低I ‑II和高III ‑IV肿瘤分级 组， 免疫组化 检测两组患者组织内KCNJ2的蛋白表达水平； (5)根据临床 资料， 进行卡方检验， 分析KCNJ2的表达水平与患者性别、 年龄、 肿瘤 大小、 TNM分期、 淋巴结侵 袭以及远处转移的相关性； (6)对患者的生存预后进行随访， 卡普兰生存分析KCNJ2高表达与低表达患者的生存差 异； (7)根据临床资料， 进行单因素和多因素方差分析， 判断KCNJ2是否作为独立判断预后 的因素； 所述骨肉瘤 细胞系的基因表达谱 包括GSE18947、 GSE490 03和GSE66673。 6.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法， 其特征在于， 所述步骤二中的KCNJ2对骨肉瘤 细胞转移的功能学分析包括： 利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建 sh‑KCNJ2和NC细胞： 利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv ‑KCNJ2和Vector细胞； 所述利用靶向KCNJ2的短发卡RNA和无义序列构建 sh‑KCNJ2和NC细胞包括： (1)将sh‑KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2OS和43B置于六孔板中， 划痕实验检测各组细胞的权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115074440 A 2迁移能力； (2)将sh‑KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞U2 OS和143B置于六孔板中， transwell实验检测各组 细胞的侵 袭能力； (3)裸鼠尾静脉注射sh ‑KCNJ2和NC的骨肉瘤细胞143B细 胞后， 观察各组裸鼠的生存率； 安乐死裸鼠后， 检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。 7.如权利要求6所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法， 其特征在于， 所述利用KCNJ2过表达慢病毒以及空载体病毒构建Lv ‑KCNJ2和Vector细胞包括： (1)将Lv‑KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中， 划痕实验检测各组 细胞的迁移能力； (2)将Lv‑KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞U2OS和143B置于六孔板中， transwell实验检测 各组细胞的侵 袭能力； (3)裸鼠尾静脉注射Lv ‑KCNJ2和Vector的骨肉瘤细胞143B细胞后， 观察各组裸鼠的生 存率； 安乐死裸鼠后， 检测各组裸鼠肺内的转移灶数量。 8.如权利要求4所述的KCNJ2/HIF1α正反馈环路促进骨肉瘤转移的方法， 其特征在于， 所述步骤三中的KCNJ2调控HIF1α 蛋白稳定性及调控其下游靶基因的表达的分子机制分析 包括： (1)应用抗KCNJ2的抗体， 免疫沉淀KCNJ2以及相互结合的蛋白后， 采用质谱的手段鉴定 KCNJ2的结合蛋白； (2)应用抗KCNJ2的抗体， 沉淀KCNJ2以及相互结合的蛋白后， 进行免疫印迹， 检测KCNJ2 与HIF1α 的表达； (3)根据KCNJ2和HIF1α蛋白的不同功能域， 构建质粒； 以GST  pull down的技术分析 KCNJ2与HIF1α 结合的肽段； (4)KCNJ2和HIF1α 蛋白的不同功能域， 构建质粒； 质粒导入至双酵母杂交系统中， 分析 KCNJ2与HIF1α 结合的肽段； (5)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和Lv ‑KCNJ2组细胞置于21％常氧和0.5％缺氧条件下， 免疫 印迹检测各组细胞HIF1α 的表达； (6)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和 Lv‑KCNJ2组细胞置于常氧和 缺氧条件下， 免疫荧光检测 各组细胞HIF1α 的核转 位情况； (7)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和 Lv‑KCNJ2组细胞置于常氧和 缺氧条件下， 同时加入放线 菌酮处理0、 30min、 60min和120mi n， 免疫印迹检测各组细胞HIF1α 降解效率； (8)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和Lv ‑KCNJ2组HIF1α 置于常氧和缺氧条件下， 同时分别加入 广谱蛋白酶抑制剂MG132和自噬抑制剂氯喹处理细胞2h， 免疫 印迹检测 两种抑制剂对细胞 中HIF1α 表达的影响； (9)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和Lv ‑KCNJ2组HIF1α置于常氧和缺氧条件下， 加入泛素后， 检测各组细胞中HIF1α 的泛素化情况； (10)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和Lv ‑KCNJ2组HIF1α 置于常氧和缺氧条件下， qRT ‑PCR检测 各组细胞中HIF1α 下游靶基因的转录水平； (11)将NC、 sh ‑KCNJ2、 Vector和Lv ‑KCNJ2组HIF1α置于常氧和缺氧条件下， 免疫印迹检 测各组细胞中HIF1α 下游靶基因的蛋白表达水平；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115074440 A 3